【摘要】：目的研究SOCS1沉默的樹突狀細胞特異性抗腫瘤作用機制,并探討RNAi技術在喉癌基因治療中的應用前景,為樹突狀細胞的臨床應用提供新思路和理論依據(jù)。方法以細胞因子GM-CSF、IL-4和TNF-α體外誘導擴增外周血單核細胞來源的DC,倒置顯微鏡下觀察DC形態(tài)特征;構建RNAi載體轉染DC,Western blot檢測SOCS1的表達情況,篩選抑制SOCS1表達的有效靶序列;流式細胞術檢測DC表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表達;ELISA法分析上清中IFN-γ的含量;MTT法評估DC刺激T細胞增殖的能力及誘導細胞毒性T細胞的殺傷活性。結果 DC體外誘導培養(yǎng)成功;設計的RNAi載體經(jīng)測序驗證無誤。干擾序列5可顯著下調(diào)SOCS1表達水平;SOCS1沉默聯(lián)合喉癌Hep-2抗原致敏的DC可顯著上調(diào)表面分子標志CD83(85.61±0.96)%、CD86(96.86±1.20)%和HLA-DR(98.02±0.94)%的表達;該組DC能有效刺激T細胞增殖,增加IFN-γ的分泌量,最終增強CTL的特異性殺傷作用,效靶比為50:1時其殺傷活性顯著高于對照組(P0.01)。結論 SOCS1沉默并負載喉癌Hep-2抗原的DC可以產(chǎn)生高效而特異性的抗喉癌免疫應答。
【圖文】：

細胞周圍開始出現(xiàn)細小的樹突狀偽足；培養(yǎng)第 5 天細胞呈積聚趨勢，形成大小不等的細胞集落，同時 DC 表面有許多微絨毛樣突起 (圖 1)；第 7天細胞表面出現(xiàn)大量伸展的須狀毛刺呈典型的 DC形態(tài)。

2.2 RNAi 載體的鑒定 目的基因（SOCS1）RNAi 載體經(jīng) AgeⅠ和 EcoRⅠ雙酶切后于 1％瓊脂糖凝膠中電泳，PCR 鑒定陽性克隆(圖 2)，陽性克隆 PCR 產(chǎn)物出現(xiàn) 366 bp 條帶，空載體克隆 PCR 產(chǎn)物出現(xiàn) 307 bp條帶，與預期相符。測得序列與原始序列進行比對結果吻合。2.3 SOCS1 沉默效率 在蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量 24 000的條帶相對應的位置顯色的條帶判定為 SOCS1。RNAi 的各組 DC 在蛋白水平上 SOCS1 表達有顯著性差異(圖 3)。RNAi 組與陰性對照組(條帶 2 和 3)相比，SOCS1 蛋白量減少，干擾序列 5 和干擾序列 6SOCS1表達顯著降低(條帶 8 和 9)，其中以 SOCS1-siRNA-5 干擾效果最明顯(條帶 8)。2.4 DC 表型分析 流式檢測結果顯示，，SOCS1-siR－NA 聯(lián)合 Hep-2 抗原致敏的 DC 組(A 組)高表達成熟表面分子標志 CD83、CD86 和 HLA-DR
【作者單位】： 遼寧醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科;北京大學第三醫(yī)院普外科;遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院眼科;
【基金】：遼寧省自然基金(20082180)
【分類號】：R739.65

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本文編號：2516544