發(fā)布時間：2019-07-02 10:08

【摘要】： 目的 1.研究CYR61 (cysteine-rich 61; CCN1)對脈絡膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞(RF／6A細胞系)增殖、遷移及形成管狀結構的影響。 2.研究CYR61在糖尿病小鼠和正常小鼠視網(wǎng)膜的表達和分布情況及其差異。 3.研究增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)患者玻璃體CYR61的表達水平,以及CYR61在視網(wǎng)膜增殖膜內(nèi)的表達和分布。 方法 1.通過MTT比色實驗觀察CYR61對RF／6A細胞增殖能力的影響：應用Transwell小室觀察CYR61作用下,RF／6A細胞遷移能力的變化；采用Matrigel基質(zhì)膠,觀察CYR61對RF／6A細胞形成管狀結構的影響。 2.腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制作糖尿病小鼠模型,通過免疫組織化學方法觀察CYR61在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜的表達和分布,利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法分析視網(wǎng)膜Cyr61 mRNA的表達情況。 3.收集玻璃體切除手術患者的玻璃體液和視網(wǎng)膜前膜,利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)方法測定PDR患者和非糖尿病患者玻璃體CYR61的濃度,利用免疫組織化學方法觀察CYR61在PDR、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)和特發(fā)性黃斑前膜患者的視網(wǎng)膜前膜中的表達和分布情況。 結果 1.用不同濃度的CYR61(0,5ng/mL, 10ng/mL,50ng/mL, 100ng/mL,500ng/mL)干預RF／6A細胞72h,隨著CYR61濃度增加,MTT比色實驗的吸光度A490nm值升高,其差異有統(tǒng)計學意義(p=0.000)；400ng/mL Cry61干預RF／6A細胞不同時間(0,12h,24h,48h,72h),隨著時間延長,A490nm值升高,其差異有統(tǒng)計學意義(Jp=0.000)。Transwell小室實驗中,隨著CYR61濃度增加,遷移的RF／6A細胞增加(p=0.000),400ng/ml CYR61促進細胞遷移的能力與80ng/ml VEGF相當,而加入抗CYR61抗體則可以起到顯著的抑制作用。Matrigel基質(zhì)膠實驗中,隨著CYR61濃度增加,RF／6A細胞形成的管狀結構增多(p=0.000),400ng/ml CYR61與80ng/ml VEGF的作用相當,而加入抗CYR61抗體則可以起到顯著的抑制作用。 2.在正常小鼠的視網(wǎng)膜,CYR61在神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)叢狀層、外從狀層和光感受器層均有表達,其中外從狀層表達較強,其余各層弱陽性染色；在糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜,CYR61同樣在以上各層表達,但神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)叢狀層的表達較正常小鼠明顯增強,神經(jīng)節(jié)細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)團塊狀的陽性染色。糖尿病小鼠視網(wǎng)膜Cyr61 mRNA的表達較正常對照組增加,差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.009)。 3.PDR組玻璃體CYR61濃度為97.53±34.13 (41.21～154.74) ng/mL,對照組玻璃體CYR61濃度為33.92±18.68 (6.24～70.04) ng/mL,兩組有顯著性差異(p=0.000)；視網(wǎng)膜和增殖膜新生血管豐富者玻璃體CYR61明顯高于無明顯新生血管者(p＝0.001)；未發(fā)現(xiàn)玻璃體CYR61與患者年齡、糖尿病病程及術前空腹血糖有關(p0.05)。CYR61分布于視網(wǎng)膜前膜的細胞胞漿中,在PDR視網(wǎng)膜前增殖膜中管腔樣結構的管壁細胞高度表達,在其它細胞也可見散在的陽性染色；PVR視網(wǎng)膜前增殖膜及特發(fā)性黃斑前膜中,有散在的陽性染色細胞。 結論 CYR61在體外可以促進脈絡膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞增殖、遷移及形成管狀結構；糖尿病小鼠視網(wǎng)膜Cyr61 mRNA和蛋白的表達均較正常小鼠升高：PDR患者玻璃體CYR61含量明顯高于非糖尿病患者,CYR61表達于PDR視網(wǎng)膜前增殖膜,尤其在管腔樣結構的管壁細胞高度表達。CYR61很可能參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病,在PDR新生血管的形成過程中起一定的作用。
[Abstract]:Purpose 1. Study CYR61 (cysteine-rich 61; CCN1) proliferation, migration and formation of tubular structures on choroidal retinal endothelial cells (RF/ 6A cell lines) Effect of CYR61 on the expression and distribution of retinal in diabetic mice and normal mice cloth and its differences.3. To study the level of the expression of CYR61 in the proliferative diabetic retinopathy (PDR) and CYR61 in the visual network membrane increase Methods 1. The effect of CYR61 on the proliferation of RF/ 6A cells was observed by MTT colorimetric assay. The effect of CYR61 on the proliferation of RF/ 6A cells was observed by MTT colorimetric assay. The effect of 61 on the formation of tubular structure of RF/ 6A cells was investigated.2. The model of diabetic mice was made by intraperitoneal injection of streptococcin (STZ). The expression and distribution of CYR61 in the retina of diabetic mice were observed by immunohistochemistry. RT-PCR was used to study the expression and distribution of CYR61 in the retina of diabetic mice. R) Method for the analysis of the expression of Cyr61 mRNA in the retina.3. Collect the vitreous humor and preretinal membrane of the patients with vitreoretinal surgery, and use the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to determine the vitreous CYR of patients with PDR and non-diabetic patients. The concentration of CYR61 in PDR, proliferative vitreoretinopathy (PV, R) And the expression and distribution of the preretinal membrane of the patients with idiopathic macular membrane. At different time (0,12 h,24 h,48 h,72 h) of the/ 6A cells, the value of A490nm increased with time, and the difference was statistically significant (Jp = 0.000). In the Transwell chamber experiment, as the concentration of CYR61 increased, the migration RF/ 6A cells increased (p = 0.000), and the ability of 400 ng/ ml CYR61 to promote cell migration was similar to that of 80. When the concentration of CYR61 increased, the tubular structure of RF/ 6A cells increased (p = 0.000),400 ng/ ml CYR61 and 80 ng/ ml as the concentration of CYR61 increased. 2. In the retina of normal mice, CYR61 was expressed in the ganglion cell layer, the inner-cluster layer, the outer-form layer and the photoreceptor layer, and the outer-form layer table In diabetic mice, CYR61 was also expressed in the above layers, but the ganglion The expression of the cell layer and the inner plexiform layer is stronger than that of the normal mouse, and the positive staining of the mass in the cytoplasm of the ganglion cell is obvious. The retina of the diabetic mouse Cyr61 mRNA expression was significantly higher than that in the control group (p = 0.009).3. The concentration of CYR61 in the PDR group was 97.53-34.13 (41.21-154.74) ng/ mL, and the concentration of CYR61 in the control group was 33.92-18.68 (6.24-70.04) ng/ mL, and there was a significant difference between the two groups (p = 0.000). Vitreous CYR61 of the retinal and proliferative membrane was significantly higher than that of the non-significant neovascular (p = 0.001); it was not found that the CYR61 was related to the age of the patient, the course of diabetes, and the pre-operative fasting blood glucose (p0.05). CYR61 was distributed in the cytoplasm of the preretinal membrane. and the cell height of the tube wall cells of the tube cavity-like structure in the preproliferative membrane of the PDR retina is highly expressed, cell Conclusion CYR61 can promote the proliferation, migration and formation of the tubular structure of the chorioretinal endothelial cells in vitro. The expression of Cyr61 mRNA and protein in the retina of the retina was higher than that in the normal mice: the vitreous CYR in the PDR The content of CYR61 was significantly higher than that of non-diabetic patients, and CYR61 was expressed in the preproliferative membrane of PDR, especially in the tube-like structure.
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R587.1;R774.1

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本文編號：2508845