【摘要】： [目的] 1.原代大鼠鼻粘膜上皮細胞的純化、培養(yǎng)及其鑒定。 2.探討環(huán)腺苷酸-蛋白激酶A (cyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase-A,cAMP-PKA)信號通路對大鼠鼻粘膜上皮細胞水通道蛋白5(aquaporin 5AQP5)調(diào)控機制。 3.SD大鼠變應性鼻炎(Allergic rhinitis, AR)動物模型的建立及其評價。 4.探討核因子kappa B(Nuclear factor kappa B NF-κB)信號通路對AQP5表達的影響。 5.探討變應性鼻炎高分泌性的可能機制。 6.探討變應性鼻炎時NF-κB信號通路和cAMP-PKA信號通路之間的cross-talk。 [方法] 1.采用差速貼壁法和條件限定培養(yǎng)基,純化和培養(yǎng)大鼠鼻粘膜上皮細胞。免疫細胞化學染色鑒定細胞類型并判斷其純度。 2.PKA抑制劑H89(3μM)和cAMP激活劑forskolin (1μM)干預鼻粘膜上皮細胞12h和24h。CCK-8法檢測H89和forskolin對上皮細胞生長的影響；免疫細胞化學染色、實時熒光定量PCR (Real-time PCR)及蛋白免疫印跡(western-blotting)檢測各組鼻粘膜上皮細胞AQP5和p-CREB(Ser133)的表達。 3.通過卵清蛋白(OVA)全身和局部致敏,建立大鼠變應性鼻炎模型,Wright's染色檢測模型組鼻腔分泌物和鼻粘膜組織嗜酸性粒細胞的表達；酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測外周血IgE水平；行為學積分對動物模型進行評價。 4. NF-κB抑制劑四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯(Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium, PDTC 100mg/kg/d和50mg/kg/d)干預AR大鼠,免疫組織化學、western-blotting和Real-time PCR檢測各組鼻粘膜組織NF-κBp65、p-CREB(Ser133)、AQP5、IL-1β、TNF-α及IL-6表達。 5.H89和forskolin干預AR大鼠,免疫組織化學、Real-time PCR和western-blotting檢測各組鼻粘膜組織,NF-κBp65. p-CREB(Ser133)、AQP5、IL-1β及TNF-α表達。 6. Western-blotting檢測各組鼻粘膜組織粘蛋白5AC(MUC5AC)和粘蛋白5B(MUC5B)表達。 [結(jié)果] 1.采用差速貼壁法和條件限定培養(yǎng)基,可成功純化和培養(yǎng)鼻粘膜上皮細胞。免疫細胞化學染色鑒定鼻粘膜上皮細胞純度可達95%。 2.H89和forskolin干預對大鼠鼻粘膜上皮細胞生長無顯著影響。H89(3μM)干預12h和24h后,p-CREB(Ser133)和AQP5陽性細胞數(shù)較對照組明顯減少,p-CREB(Ser133)蛋白、AQP5蛋白及AQP5mRNA表達較對照組明顯減少；Forskolin (1μM)干預12h和24h后,p-CREB(Ser133)和AQP5陽性細胞數(shù)較對照組明顯增多,p-CREB(Ser133)蛋白和AQP5蛋白及AQP5mRNA表達較對照組明顯增多。 3.通過卵清蛋白全身和局部致敏建立SD大鼠AR模型,HE染色顯示模型組鼻粘膜組織纖毛脫落、倒伏,血管、腺體增多,Wright's染色顯示模型組嗜酸性粒細胞浸潤；外周血IgE水平增高；行為學積分較對照組明顯增高。 4.與對照組相比,模型組鼻粘膜組織NF-κBp65平均光密度值和蛋白表達明顯增多,IL-1β、TNF-α及IL-6mRNA表達明顯增多,p-CREB(Serl33)平均光密度和蛋白表達減少,AQP5平均光密度值、蛋白表達和mRNA表達減少；PDTC (100mg/kg/d and 50mg/kg/d)干預1d、3d和5d后,NF-KBp65平均光密度值和蛋白表達較模型組減少,IL-1β、TNF-α及IL-1βmRNA表達較模型組減少,p-CREB(Ser133)平均光密度值和蛋白表達較模型組增多,AQP5平均光密度值、蛋白表達和mRNA表達較模型組增多。 5.H89 (5mg/kg/d)干預1d、3d和5d后,NF-κBp65平均光密度值和蛋白表達較模型組增多,IL-1β及TNF-αmRNA表達較模型組增多,p-CREB(Ser133)平均光密度和蛋白表達較模型組減少,AQP5平均光密度值、蛋白表達和mRNA表達較模型組減少；Forskolin (5mg/kg/d)干預1d、3d和5d后,NF-κBp65平均光密度值和蛋白表達較模型組減少,IL-1β及TNF-αmRNA表達較模型組減少,p-CREB(Ser133)平均光密度值和蛋白表達較模型組增多,AQP5平均光密度值、蛋白表達和mRNA表達較模型組增多。 6.模型組MUC5AC和MUC5B蛋白表達較對照組明顯增多；PDTC(100mg/kg/d and 50mg/kg/d)干預1d，3d和5d后,MUC5AC蛋白和MUC5B蛋白較模型組減少,H89(5mg/kg/d)干預1d,3d和5d后,MUC5AC蛋白和MUC5B蛋白表達較模型組增多。Forskolin(5mg/kg/d)干預1d,3d和5d后,MUC5AC蛋白和MUC5B蛋白表達較模型組減少。 [結(jié)論] 1.采用差速貼壁純化法和條件限定培養(yǎng)基,可獲得高純度的鼻粘膜上皮細胞。 2. cAMP-PKA信號通路通過CREB絲氨酸殘基133位點磷酸化途徑參與了鼻粘膜上皮細胞AQP5表達調(diào)控。 3.通過全身和鼻腔局部OVA致敏,可成功建立SD大鼠變應性鼻炎動物模型。 4. NF-κB信號通路可能通過抑制CREB(Ser133)磷酸化途徑或者通過NF-κBp65與p-CREB (Ser133)競爭性結(jié)合CBP途徑下調(diào)AQP5表達。 5. NF-κB信號通路上調(diào)MUC5AC蛋白和MUC5B蛋白表達,可能引起變應性鼻炎高分泌性；AQP5的表達減少導致鼻腔分泌物清除或重吸收功能障礙,加速變應性鼻炎高分泌性。 6. cAMP-PKA信號通路可抑制NF-κB信號通路。
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【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R765.21

【引證文獻】

相關博士學位論文 前2條

1 李姿慧;健脾化濕法對脾虛濕困型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠水通道蛋白3、4表達的影響及機制研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2012年

2 張敏;TLR-NF-κB信號通路在大鼠變應性鼻炎發(fā)病中的作用及雷公藤多甙干預機制的研究[D];福建醫(yī)科大學;2012年

相關碩士學位論文 前1條

1 蔡青;五龍顆粒對脾虛變應性鼻炎大鼠血清IL-5和炎癥細胞的影響[D];成都中醫(yī)藥大學;2012年

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本文編號：2468954