發(fā)布時(shí)間：2019-03-25 12:56

【摘要】：前言白內(nèi)障是世界首位致盲性眼病。目前,其治療仍以手術(shù)為主,但手術(shù)給個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。因此,深入研究其發(fā)病機(jī)制,進(jìn)行早期干預(yù),具有重要的現(xiàn)實(shí)和臨床意義。αA晶狀體蛋白(alpha A crystallin, CRYAA)是晶狀體內(nèi)主要蛋白質(zhì)之一,對(duì)維持晶狀體的透明性具有重要作用。它的分子伴侶功能可以防止晶狀體內(nèi)蛋白質(zhì)變性,保護(hù)細(xì)胞免受外界環(huán)境損傷的刺激、抵抗各種因素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。因此,本研究圍繞αA晶狀體蛋白,一方面從DNA水平探討CRYAA基因啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)與年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract, ARC)的關(guān)系,分析晶狀體內(nèi)CRYAA表達(dá)量差異的原因；另一方面從蛋白質(zhì)水平鑒定CRYAA相互作用的蛋白質(zhì),以及其形成的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)在ARC發(fā)生發(fā)展中所起的作用。第一部分CRYAA啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性與年齡相關(guān)性白內(nèi)障易感性的關(guān)系研究目的晶狀體中CRYAA的表達(dá)量在ARC患者和對(duì)照者中存在差異,而啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性是影響基因表達(dá)的因素之一。因此,本研究探討CRYAA啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性與年齡相關(guān)性白內(nèi)障易感性的關(guān)系。方法(1)觀察CRYAA啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性與ARC的相關(guān)性：研究共納入243例ARC患者(核性白內(nèi)障C2NO3P2)和1348例正常對(duì)照者(核性白內(nèi)障C2NO2P2)。采集所有研究對(duì)象外周靜脈血5ml,提取基因組DNA, PCR擴(kuò)增CRYAA基因啟動(dòng)子-1--1000區(qū)域,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序,鑒定CRYAA啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn)。通過SHEsis在線分析平臺(tái)分析ARC組和對(duì)照組在等位基因頻率和基因型頻率上的分布差異,并通過Haplotype分析觀察SNP位點(diǎn)之間的協(xié)同作用關(guān)系。(2)檢測(cè)SNP對(duì)基因表達(dá)的影響：合成CRYAA啟動(dòng)子-1--1000區(qū)域的DNA序列,將其克隆至pGL3-Basic質(zhì)粒載體,形成pGL3-Basic-CRYAA載體；根據(jù)CRYAA基因啟動(dòng)子區(qū)域鑒定結(jié)果,使用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建rs7278468的SNP位點(diǎn)突變質(zhì)粒pGL3-Basic-rs7278468載體,轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),檢測(cè)啟動(dòng)子效率。結(jié)果CRYAA啟動(dòng)子-1--1000區(qū)域共鑒定到6個(gè)SNP位點(diǎn)：rs3761381, rs3761382, rs79545821, rs13053109, rs7278468和rs117396767。在等位基因頻率分布上,只有rs7278468位點(diǎn)在ARC組和對(duì)照組之間均存在顯著差異(P0.05),對(duì)照組次要等位基因出現(xiàn)頻率大于ARC組；在基因型頻率分布上,6個(gè)SNP位點(diǎn)在ARC組和對(duì)照組之間均不存在顯著差異(P0.05)。Haplotype分析結(jié)果顯示：個(gè)體出現(xiàn)C-C-G-G-T-C分型是ARC發(fā)病的危險(xiǎn)因素(P=0.027,OR=1.258),而出現(xiàn)T-C-A-G-G-C是ARC的保護(hù)性因素(P=0.038,OR=0.736)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示SNP位點(diǎn)rs7278468次要等位基因的出現(xiàn)增強(qiáng)了啟動(dòng)子效率,進(jìn)而細(xì)胞內(nèi)CRYAA表達(dá)量上升。結(jié)論CRYAA基因啟動(dòng)子區(qū)SNP是個(gè)體ARC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)差異的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。單個(gè)位點(diǎn)的SNP影響CRYAA的蛋白質(zhì)表達(dá)量。多個(gè)SNP位點(diǎn)間的協(xié)同作用則對(duì)ARC發(fā)生發(fā)展有著不同的影響：Haplotype分型C-C-G-G-T-C是其危險(xiǎn)因素,而Haplotype分型T-C-A-G-G-C是其保護(hù)性因素。第二部分CRYAA蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中的作用研究目的CRYAA分子伴侶功能的本質(zhì)是蛋白質(zhì)之間的相互作用,因此本研究通過蛋白芯片的方法鑒定與CRYAA相互作用的蛋白質(zhì),分析其蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)在ARC發(fā)展中可能存在的作用。方法 (1)相互作用蛋白質(zhì)的鑒定：使用含有人類蛋白質(zhì)組17225個(gè)蛋白質(zhì)的HuProt蛋白芯片鑒定蛋白質(zhì)相互作用。根據(jù)CRYAA的1-173個(gè)氨基酸合成CRYAA蛋白質(zhì),將4ng/μl的CRYAA與蛋白芯片共同孵育1.5小時(shí)(對(duì)照組給予PBST溶液),其后分別給予CRYAA一抗(1：1000)和IgG-Cy3標(biāo)記的二抗(1：200)各孵育1小時(shí)。使用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀檢測(cè)陽性信號(hào),讀取芯片上每點(diǎn)F532和B532數(shù)值,并根據(jù)公式計(jì)算信噪比(Signal Noise Ratio, SNR): SNR=MeanF532-MeanB532/SDB532。選擇SNR≥1.2作為篩選CRYAA相互作用蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)鑒定到SNR≥1.2的蛋白質(zhì),通過Gene Ontology和DAVID網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)生物學(xué)功能分析,通過string和KEGG蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析蛋白質(zhì)之間的相互聯(lián)系,進(jìn)而建立CRYAA蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),分析CRYAA參與的影響ARC發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)進(jìn)程。(2)選取數(shù)個(gè)蛋白芯片鑒定到的CRYAA相互作用蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證：合成CRYAA基因編碼區(qū)DNA序列,克隆至p3xFlag-CMV-7.1 質(zhì)粒載體,形成 p3xFlag-CMV-CRYAA質(zhì)粒載體。將p3xFlag-CMV-CRYAA載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,使細(xì)胞內(nèi)表達(dá)帶有Flag標(biāo)簽的CRYAA。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,將全蛋白裂解液與抗Flag的M2 beads共同孵育,從而免疫共沉淀CRYAA與其相互作用蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物,經(jīng)Western blot鑒定此復(fù)合物中與CRYAA相互作用的蛋白質(zhì)。結(jié)果對(duì)照組共有343個(gè)蛋白質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度高于CRYAA組,其中127個(gè)蛋白質(zhì)SNR≥1.2。8個(gè)CRYAA相互作用蛋白質(zhì)SNR≥3.0：造血細(xì)胞特異性Lyn底物蛋白1 (hematopoietic cell-specific Lyn substrate 1, HCLS1)、Kelch樣蛋白6(Kelch domain containin 6, KLHDC6)、肌營養(yǎng)蛋白δ(sarcoglycan delta, SGCD)、KIAA1706蛋白(KIAA1706 protein, KIAA1706)、5’-三磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶(RNA guanylyltransferase and 5'-phosphatase, RNGTT)、10號(hào)染色體開放閱讀框57 (chromosome 10 open reading frame 57, C10orf57),9號(hào)染色體開放閱讀框52 (chromosome 9 open reading frame 52, C9orf52)和尿激酶型纖溶酶原激活物受體(plasminogen activator, urokinase receptor, PLAUR)。通過Gene Ontology 和 DAVID網(wǎng)站進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)CRYAA相互作用的蛋白質(zhì)涉及多種功能類別：磷酸化蛋白(Phosphoprotein)、選擇性剪切(Alternative splicing)、DNA結(jié)合蛋白(DNA binding)、細(xì)胞周期(Cell cycle)、細(xì)胞骨架(Cytoskeleton)、線粒體(Mitochondrion)、凋亡(Apoptosis)、蛋白水解(Proteolysis)、細(xì)胞對(duì)壓力的反應(yīng)(Cellular response to stress)、DNA損傷修復(fù)(DNA repair)、自體吞噬(Autophagy)等。選取細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)HCLS1、MAPK信號(hào)通路蛋白MAPKBP1、MORG1和熱休克蛋白HSPB1進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示CRYAA在細(xì)胞內(nèi)與這些蛋白質(zhì)形成復(fù)合物,即通過與這些蛋白質(zhì)相互作用從而行使其在不同生物學(xué)進(jìn)程中的功能。結(jié)論CRYAA與多種蛋白質(zhì)相互作用從而參與眾多生物學(xué)功能和進(jìn)程,維持晶狀體的透明性：通過骨架蛋白維持細(xì)胞膜穩(wěn)定,如HCLS1；通過細(xì)胞周期蛋白質(zhì)維持晶狀體上皮細(xì)胞活力；通過應(yīng)激反應(yīng)蛋白質(zhì)降低氧化損傷的傷害：如HSPB1；通過凋亡通路(MAPK.P13K/AKt信號(hào)通路)及DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白質(zhì)抑制細(xì)胞凋亡,如MAPKBP1和MORGl；通過泛素化-蛋白酶體及自體吞噬系統(tǒng)促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R776.1

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1 樊琪;CRYAA啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性及其蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中的作用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：2446998