【摘要】：背景與目的 人乳頭狀瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)可引起一系列上皮病變,有些型別HPV與癌前病變相關(guān),稱為高危型HPV,部分人感染高危型HPV后可發(fā)生癌變。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)在1995年認(rèn)定HPV-16, HPV-18兩種型別在人類有致癌作用。宮頸癌與高危型HPV感染的相關(guān)性已得到普遍認(rèn)可。流行病學(xué)、分子和臨床證據(jù)表明,高危型HPV感染除了與宮頸癌有強(qiáng)烈相關(guān)性之外,還與部分頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and neck Squamous cell carcinoma, HNSCC)的發(fā)生密切相關(guān)。 在HPV相關(guān)的HNSCC中,目前研究最多的是口咽部鱗狀細(xì)胞癌(Oropharyngeal squamous cell carcinoma, OSCC)。臨床證據(jù)表明,HPV相關(guān)OSCC通常不具備此類疾病中典型的大量抽煙和／或飲酒病史,在生物學(xué)行為上不同于經(jīng)典的OSCC, HPV感染與否對OSCC病人的預(yù)后有顯著影響,無論是治療效果還是生存率,HPV陽性O(shè)SCC病人都優(yōu)于HPV陰性O(shè)SCC病人。 喉鱗癌和喉咽鱗癌是HNSCC中兩種常見惡性腫瘤,多發(fā)于中老年男性,大量抽煙和／或飲酒是其公認(rèn)的致癌因素,然而有一部分患者并無大量抽煙和／或飲酒的病史,針對這部分患者的發(fā)病原因,研究者將目光轉(zhuǎn)向了HPV感染。許多研究機(jī)構(gòu)對喉鱗癌和喉咽鱗癌組織中HPV感染情況進(jìn)行了檢測,以往的研究多為回顧性研究,檢測的癌組織來自病理存檔標(biāo)本,病人臨床資料的獲得受到諸多限制。此外,喉部與喉咽部解剖位置毗鄰,部分晚期癌腫僅憑病理標(biāo)本不易鑒別原發(fā)位置,鑒于喉鱗癌發(fā)病率顯著高于喉咽鱗癌,大多數(shù)研究者便將喉咽鱗癌歸入喉鱗癌一并研究。因此,報道喉鱗癌HPV感染率的文獻(xiàn)很多,但鮮有喉咽鱗癌HPV感染情況的報道,HPV在喉咽鱗癌中的感染率及常見感染型別均不明確。 喉咽鱗癌和喉鱗癌的臨床表現(xiàn)有一定的相似性,但卻是原發(fā)于不同解剖部位的兩種HNSCC,二者的分化程度、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及5年生存率有明顯不同,喉咽鱗癌的預(yù)后更差。而且目前研究認(rèn)為HPV感染主要與HNSCC的預(yù)后相關(guān),因此在開展HPV感染相關(guān)性研究時,有必要將喉咽鱗癌與喉鱗癌進(jìn)行區(qū)分,將喉咽鱗癌作為獨立的疾病進(jìn)行相關(guān)研究。本課題擬對收集的28例喉咽鱗癌新鮮冰凍組織標(biāo)本進(jìn)行HPV DNA檢測并分型,了解人喉咽鱗癌組織中HPV感染情況及常見HPV型別。 E6、E7基因為HPV基因組早期區(qū)基因,編碼E6、E7蛋白,HPV-16編碼的E6、E7蛋白是其發(fā)揮致癌作用的主要癌蛋白。慢病毒載體(Lentivirus vector)可以高效率且穩(wěn)定的感染各期細(xì)胞,是將基因整合入細(xì)胞的良好運載工具,且具有操作簡便、感染效率高、作用穩(wěn)定、安全性好等優(yōu)點。本課題擬利用重組HPV-16E6-E7基因的慢病毒感染人喉咽鱗癌FaDu細(xì)胞,觀察HPV-16E6-E7基因整合對FaDu細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 微小RNA (miRNA或microRNA)參與了人體細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、侵襲、及遷移等幾乎所有的細(xì)胞生物學(xué)過程。miRNAs的異常表達(dá)與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān),可發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用。然而目前對HPV相關(guān)HNSCC的]miRNAs表達(dá)情況了解有限。本課題擬對僅感染HPV-16和HPV陰性的喉口咽鱗癌組織miRNAs表達(dá)水平進(jìn)行檢測,同時檢測人喉咽鱗癌FaDu細(xì)胞整合HPV-16E6-E7前后miRNAs表達(dá)水平的變化,分析HPV-16感染對人喉咽鱗癌組織和細(xì)胞株miRNAs表達(dá)的調(diào)控。 第一部分人喉咽鱗癌新鮮冰凍組織中HPV檢測及分型 方法 1.收集28例人喉咽鱗癌新鮮組織標(biāo)本,液氮速凍后移入-80℃低溫冰箱保存。 2.應(yīng)用基因組DNA小量試劑盒提取新鮮冰凍喉咽鱗癌組織標(biāo)本基因組DNA。 3.PCR-反向點雜交法檢測標(biāo)本中HPV DNA并分型 4.將HPV感染情況與病人臨床資料相結(jié)合,進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果 1.28例喉咽鱗癌標(biāo)本HPV感染情況如下：HPV陽性者7例,總陽性率為25.0%(7/28)。5例為單一型別HPV感染,HPV-16型3例,HPV-18型1例,HPV-52型1例；2例為兩種型別HPV同時感染,HPV-16,33型1例,HPV-16,52型1例。 2.HPV陽性與HPV陰性病人相比較,大量抽煙和／或飲酒病史有顯著性差異(P0.05)；年齡、性別、病理分型和腫瘤T分期之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05) 第二部分HPV-16E6-E7基因整合對FaDu細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 方法 1.重組HPV-16E6-E7慢病毒的制備：全基因合成HPV-16E6-E7基因,并在兩端分別加上HindⅢ和KpnⅠ限制性核酸內(nèi)切酶位點,與慢病毒載體pLV-EGFP-C在T4連接酶的作用下連接,將連接體系轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)菌,挑選長出的菌落進(jìn)行測序鑒定,即得到重組HPV-16E6-E7慢病毒。 2.重組HPV-16E6-E7慢病毒的包裝： 制備用于包裝的質(zhì)粒DNA溶液：將慢病毒包裝載體pH1、pH2與重組HPV-16E6-E7'慢病毒質(zhì)粒按照一定比率混合于50mL無血清DMEM培養(yǎng)基中。 》制備轉(zhuǎn)染試劑稀釋液：取一定體積的轉(zhuǎn)染液Polyfect-V與500μL無血清DMEM培養(yǎng)基混合。 將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液加入用于包裝的質(zhì)粒DNA溶液中,立刻充分混勻,即制備成為轉(zhuǎn)染混合液。室溫孵育轉(zhuǎn)染混合液15min,消化HEK293T細(xì)胞,每lml轉(zhuǎn)染混合液加入10ml細(xì)胞懸液,輕輕吹吸細(xì)胞混勻。將細(xì)胞懸液加入10cm培養(yǎng)皿,放入37℃培養(yǎng)24h。去除含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基,用10ml病毒培養(yǎng)基換液。轉(zhuǎn)染后48h培養(yǎng)上清即含病毒顆粒,收集并測定病毒滴度,.80-C保存。 3.重組HPV-16E6-E7漫病毒感染人喉咽鱗癌FaDu細(xì)胞：復(fù)蘇FaDu細(xì)胞,用含有重組HPV-16E6-E7慢病毒顆粒的慢病毒液感染FaDu細(xì)胞。48h后觀察熒光表達(dá)情況,用含有0.5μg/mL puromycin的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng),3周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。PCR檢測FaDu細(xì)胞中HPV-16E6、E7DNA, RT-PCR檢測FaDu細(xì)胞中HPV-16E6、E7mRNA, Western-blot檢測細(xì)胞中E6、E7蛋白。 4.將細(xì)胞分為3組：實驗組(重組HPV-16E6-E7慢病毒穩(wěn)定感染的FaDu細(xì)胞)、載體對照組(慢病毒空載體穩(wěn)定感染的FaDu細(xì)胞)和空白對照組(未感染慢病毒的FaDu細(xì)胞)。 5. CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞增殖情況,分別測定實驗組、載體對照組和空白對照組細(xì)胞孔內(nèi)的吸光度值(A),繪制各組細(xì)胞的生長曲線。 6.收集各組細(xì)胞,通過PI染色用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化；通過PI和Annexin-V聯(lián)合染色檢測細(xì)胞的凋亡。 7.分別收集實驗組、載體對照組和空白對照組細(xì)胞,酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性。 8. Transwell侵襲實驗,檢測各組細(xì)胞的體外侵襲能力變化。將Matrigel膠均勻鋪于聚碳酸酯膜內(nèi)表面,在上室分別加入三組細(xì)胞懸液各l00μL,在下室中加.A.500-L含趨化因子的DMEM完全培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)箱孵育48h,計算侵襲細(xì)胞數(shù)。 結(jié)果 1.重組HPV-16E6-E7慢病毒測序結(jié)果與設(shè)計序列進(jìn)行同源性比較分析,結(jié)果顯示目的DNA E6-E7序列與設(shè)計序列完全一致； 2.慢病毒滴度測定結(jié)果：重組HPV-16E6-E7漫病毒滴度為1.15×108MOI,空載體慢病毒滴度為2.09×108MOI。 3.重組HPV-16E6-E7慢病毒感染人喉咽鱗癌FaDu細(xì)胞及篩選結(jié)果顯示：重組HPV-16E6-E7'慢病毒和空載體慢病毒感染FaDu細(xì)胞48h后用熒光顯微鏡觀查,在感染上述慢病毒的細(xì)胞中可見明亮的綠色熒光蛋白EGFP表達(dá)。說明得到穩(wěn)定感染重組HPV-16E6-E7'慢病毒和空載體慢病毒的FaDu細(xì)胞。 4.收集重組HPV-16E6-E7慢病毒感染后的FaDu細(xì)胞,提取細(xì)胞基因組DNA,用E6和E7基因上下游引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。1.5%瓊脂糖凝膠電泳可見,在接近500bp處有一明亮條帶,與HPV-16E6基因序列的理論值474bp一致；在接近250bp處也有一明亮條帶,與HPV-16E7序列的理論值297bp一致。 5. RT-PCR結(jié)果顯示：重組HPV-16E6-E7'慢病毒穩(wěn)定感染的FaDu細(xì)胞中HPV-16E6、E7mRNA相對表達(dá)量分別為(2.6±0.22和1.8±0.12),明顯高于空載體組(0.003±0.0001和0.003±0.0002)和未轉(zhuǎn)染組(0.002±0.0002和0.005±0.0001),有顯著性差異(P0.05)。 6.免疫印跡結(jié)果顯示重組HPV-16E6-E7曼病毒穩(wěn)定感染的FaDu細(xì)胞有明顯的E6. E7蛋白印跡條帶。與RT-PCR檢測mRNA結(jié)果一致,說明制備的重組HPV-16E6-E7'慢病毒感染FaDu細(xì)胞后能夠高效表達(dá)E6、E7蛋白。 7. CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒分別測定各組細(xì)胞孔內(nèi)的吸光度值(A),實驗組在第2d、3d、4d、5d的吸光度值分別為0.6418±0.0391、1.0808±0.0878、1.3598±0.0464、1.5936±0.1107與載體對照組(0.5442±0.01490、0.8952±0.0358、1.2002±0.0549、1.3848±0.0388)和空白對照組(0.5268±0.0320、0.888±0.03302、1.2162±0.0320、1.4228±0.0444)比較,吸光度值(A)明顯升高,有顯著性差異(p0.05)。 8.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測各組細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：實驗組(7.246±0.815)與載體對照組(13.464±0.609)和空白對照組(13.298±1.324)比較,細(xì)胞凋亡率顯著降低,均有顯著性差異(p＜0.01)；空白對照組與載體對照組比較,平均細(xì)胞凋亡率無顯著性差異(p＞0.05)。說明HPV-16E6-E7整合可抑制FaDu細(xì)胞的凋亡。 9.酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性結(jié)果顯示：實驗組、載體對照組和空白對照組Caspase-3相對活性分別為1.398±0.106、2.538±0.24和2.587±0.19; Caspase-9相對活性分別為1.268±0.083、1.992±0.13和1.984±0.11。實驗組與2個對照組(空白對照組和載體對照組)細(xì)胞相比較,Caspase-3、Caspase-9相對活性均顯著降低,均有顯著性差異(p0.01)。 10.流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示：實驗組GO-G1期、S期和G2-M期各期所占比率分別為53.816±1.665、28.836±1.013和17.348±0.878；載體對照組分別為62.284±1.609、22.292±0.970和15.424±1.236；空白對照組分別為62.262±2.139、22.664±1.551和15.074±1.451。空白對照組與載體對照組細(xì)胞S期、G2/M期和G0/G1細(xì)胞比例比較,差異無顯著性(p0.05)實驗組與2個對照組(空白對照組和載體對照組)比較,S期和G2/M期細(xì)胞比例增加,G0/G1期細(xì)胞比例減少,有顯著性差異(p＜0.05)。說明FaDu細(xì)胞基因組整合HPV-16E6-E7后,S期和G2/M期細(xì)胞比例增加,G0/G1期細(xì)胞比例減少,促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖。 11.細(xì)胞Transwell實驗結(jié)果顯示：實驗組體外侵襲實驗視野內(nèi)平均細(xì)胞數(shù)為117.4±14.8,載體對照組和空白對照組分別為68.4±8.2和72±8.1,實驗組與2個對照組(載體對照組和空白對照組)比較,穿透Matrigel的平均細(xì)胞數(shù)顯著增加,有顯著性差異(p＜0.01)。說明FaDu細(xì)胞基因組整合HPV-16E6-E7后,FaDu細(xì)胞穿透Matrigel的能力顯著增強(qiáng),細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。 第三部分HPV-16感染對喉咽鱗癌組織及FaDu細(xì)胞miRNA表達(dá)的調(diào)控 方法 1.穩(wěn)定培養(yǎng)實驗組、載體對照組和空白對照組FaDu細(xì)胞,確認(rèn)3例僅HPV-16感染及21例HPV陰性的新鮮冰凍喉咽鱗癌組織。 2.提取人喉咽鱗癌組織及各組細(xì)胞總RNA。 3. qRT-PCR檢測各組標(biāo)本及細(xì)胞總RNA中miR-363、miR-15a和miR-155的表達(dá)水平。 結(jié)果 1.僅感染HPV-16的喉咽鱗癌組織標(biāo)本中IniR-363、miR-15a和miR-155的表達(dá)水平分別為5.62±3.48、1.97±0.48和0.34±0.08；HPV陰性的喉咽鱗癌組織標(biāo)本中各miRNA表達(dá)水平分別為0.90±1.53、1.09±1.31和1.92±1.47；實驗組細(xì)胞中各,miRNA表達(dá)水平分別為6.75±0.17、4.15±0.13和0.16±0.01；載體對照組細(xì)胞中各miRNA表達(dá)水平分別為0.09±0.01、0.20±0.01和7.01±1.04；空白對照組細(xì)胞中各miRNA表達(dá)水平分別為0.09±±.0.003、0.21±0.003和4.14±0.02。 2.與HPV-16陰性的人喉咽鱗癌組織相比,HPV-16陽性人喉咽鱗癌組織中miR-363、miR-15a表達(dá)顯著上調(diào),miR-155表達(dá)無顯著變化；與未轉(zhuǎn)染HPV-16E6-E7基因的FaDu細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染HPV-16E6-E7基因的FaDu細(xì)胞中miR-363、miR-15a表達(dá)顯著上調(diào),miR-155表達(dá)無顯著變化；HPV-16陽性的人喉咽鱗癌組織與整合HPV-16E6-E7的FaDu細(xì)胞中miR-363、miR-15a和miR-155表達(dá)水平無顯著性差異；HPV-16陰性的人喉咽鱗癌組織與未整合HPV-16E6-E7的FaDu細(xì)胞中niR-363、miR-15a和miR-155表達(dá)水平亦無顯著性差異。 結(jié)論 1.喉咽鱗癌組織中存在HPV感染,本組標(biāo)本中HPV陽性率為25.0%(7/28),HPV-16是最常見的感染型別； 2.在本課題包含的28例喉咽鱗癌病人中,與HPV陰性病人相比,HPV陽性病人中具有大量抽煙和/或飲酒病史者較少,差異有顯著性； 3.人喉咽鱗癌FaDu細(xì)胞基因組整合HPV-16E6-E7后,細(xì)胞的增殖能力和侵襲力增強(qiáng),細(xì)胞凋亡受到抑制,S期和G2/M期細(xì)胞比例增加,G0/G1期細(xì)胞比例減少。 4.在HPV-16陽性喉咽鱗癌組織和轉(zhuǎn)染HPV-16E6-E7基因的FaDu細(xì)胞中,miR-363、miR-15a表達(dá)顯著上調(diào),miR-155表達(dá)無明顯變化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R739.6

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7 周海濤;慢病毒介導(dǎo)的Nanog基因?qū)χ車窠?jīng)損傷性神經(jīng)病理性疼痛模型脊髓突觸重塑的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2012年

8 劉濤;慢病毒介導(dǎo)的Foxa2和Hnf4a組成性表達(dá)對胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的影響[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2009年

9 田青水;慢病毒介導(dǎo)的RECK基因治療胰腺癌的實驗研究[D];蘇州大學(xué);2011年

10 周健;慢病毒介導(dǎo)靶向沉默誘騙受體3（DcR3）在胰腺癌中誘導(dǎo)凋亡的實驗研究[D];蘇州大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 陳維;慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎的初步研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

2 孫克寧;利用慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因小鼠和牛胚胎的研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 劉永才;64層螺旋CT后處理技術(shù)在喉及喉咽疾病診斷中的應(yīng)用價值[D];浙江大學(xué);2011年

4 張旭;miR-122對HBV感染的肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2012年

5 毛亞江;腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白Mtss1慢病毒干擾載體的構(gòu)建和鑒定[D];湖南師范大學(xué);2010年

6 張文娟;慢病毒介導(dǎo)豬HOXB4基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)的研究[D];吉林大學(xué);2013年

7 黃敏;重組慢病毒載體介導(dǎo)艾滋病毒Rev蛋白調(diào)控卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒裂解性周期復(fù)制的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

8 陳麗妹;Grb2抑制對腸癌細(xì)胞HT29腫瘤相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2012年

9 韓騰龍;用慢病毒載體介導(dǎo)癌基因建立細(xì)胞衰老的模型[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

10 劉漢屈;Hyper-IL-6重組慢病毒促肝細(xì)胞增殖及對大鼠急性肝衰竭保護(hù)作用的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

本文編號：2426524