【摘要】： 哺乳動物耳蝸Corti器具有非常精密的結(jié)構(gòu),是感知聲音的器官,正常聽力的維持需要一定數(shù)量的毛細胞參與,當(dāng)某些因素如過度聲刺激、使用耳毒性藥物、年齡衰老等引起的內(nèi)外毛細胞不可逆性的損傷,必將導(dǎo)致永久性感音神經(jīng)性耳聾。傳統(tǒng)觀點認為,哺乳動物毛細胞不具備再生的能力,所以,迄今為止,有效治療感音神經(jīng)性耳聾仍是耳科臨床醫(yī)生的難題。 近年來,隨著對內(nèi)耳感覺上皮發(fā)育分子機制研究的深入,發(fā)現(xiàn)Math1基因是毛細胞分化所必需的基因;很多研究表明Notch信號相關(guān)的靶基因家族,其中主要有Hes1、Hes5基因;在哺乳動物內(nèi)耳感覺上皮的定向分化,特別在毛細胞的形成中起關(guān)鍵作用,并參與側(cè)抑制的調(diào)控及基底膜嵌合體的形成。在體內(nèi)外過表達math1基因或加入γ-分泌酶抑制劑,均能夠使耳蝸產(chǎn)生新的毛細胞樣細胞。但是單獨應(yīng)用時,在動物體內(nèi)產(chǎn)生的毛細胞數(shù)往往非常有限,怎樣才能使毛細胞數(shù)產(chǎn)生的更多呢?如果γ-分泌酶抑制劑和過表達math1基因兩者聯(lián)合應(yīng)用是否會產(chǎn)生更多的毛細胞?目前還沒有相關(guān)研究。本研究通過離體培養(yǎng)新生(P1)大鼠耳蝸基底膜為實驗基礎(chǔ),觀察離體培養(yǎng)的基底膜毛細胞生長發(fā)育與在體耳蝸P1、P7、P14毛細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及排列方式的區(qū)別,并觀察使用γ-分泌酶抑制劑DAPT和轉(zhuǎn)染ad-math1-EGFP過表達外源性math1基因后,對毛細胞發(fā)育、分化等影響,運用多種形態(tài)學(xué)方法對不同條件下離體培養(yǎng)基底膜毛細胞的變化作初步研究,以便為在體實驗提供參考。研究分以下兩個部分。 第一部分離體培養(yǎng)與在體Corti’s器毛細胞發(fā)育比較 目的:觀察比較離體培養(yǎng)的基底膜毛細胞與在體耳蝸毛細胞的生長發(fā)育規(guī)律。 方法:將新生P0、P7、P14 SD大鼠消毒后,斷頭取出各階段的耳蝸固定灌流;將部分P0在L15液里分離出帶螺旋神經(jīng)節(jié)的基底膜,修剪后,貼壁培養(yǎng),分別培養(yǎng)7天、14天,采用掃描電鏡觀察離體培養(yǎng)后和P0、P7、P14在體動物耳蝸基底膜毛細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果:掃描電鏡下在體P0、P7、P14大鼠耳蝸毛細胞從出生至毛細胞基本發(fā)育成熟,絕大部分都是以1排內(nèi)毛細胞和3排外毛細胞的方式排列的。毛細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及排列方式隨著時間的改變逐漸發(fā)育成熟;P14耳蝸毛細胞各個部分已經(jīng)完全發(fā)育成熟,柱細胞頭板增寬,各細胞表面微絨毛減少,動纖毛從底圈至頂圈逐漸退化已經(jīng)基本結(jié)束。離體培養(yǎng)7天時,基底膜毛細胞生長狀況良好,以1排內(nèi)毛細胞和3排外毛細胞排列,毛細胞靜纖毛逐漸發(fā)育成熟;培養(yǎng)14天時,大部分只剩1排內(nèi)毛細胞和1-2排外毛細胞,基底膜毛細胞形態(tài)很差,基本上發(fā)生融合、缺失,甚至皮板塌陷。 結(jié)論:1、在P0-P14這個時間段,大鼠耳蝸Corti器由底圈到頂圈,內(nèi)毛細胞、外毛細胞及支持細胞由不成熟到成熟的逐漸發(fā)育過程。2、體外培養(yǎng)7天的基底膜總體生長狀態(tài)良好,內(nèi)外毛細胞及支持細胞逐漸發(fā)育成熟;培養(yǎng)14天的基底膜生長狀態(tài)差,不同類型的細胞結(jié)構(gòu)均已破壞。 第二部分DAPT與Mathl聯(lián)合應(yīng)用對離體培養(yǎng)Corti’s器毛細胞發(fā)育與再生的影響 目的:研究將γ-分泌酶抑制劑(DAPT)和ad-Math1-EGFP兩者聯(lián)合應(yīng)用,觀察是否比單獨應(yīng)用DAPT或ad-Math1-EGFP更能促進哺乳動物內(nèi)耳毛細胞的發(fā)育和分化。 方法:取材和培養(yǎng)方法同第一部分,隨機分為正常培養(yǎng)組、DAPT組、ad-math1-EGFP組、DAPT+ad-math1-EGFP組,按培養(yǎng)時間又分為4天、7天和9天組。其中DAPT為γ-分泌酶抑制劑,溶解于終濃度低于0.1%的DMSO,每日換液均加入DAPT; ad-math1-EGFP組基底膜轉(zhuǎn)染ad-math1-EGFP 1天,之后每天換液;DM組為培養(yǎng)時即加入DAPT,在8h后轉(zhuǎn)染ad-math1-EGFP 1天,之后換液同DAPT組。采用免疫組織化學(xué)染色、掃描電鏡及半薄切片觀察基底膜毛細胞數(shù)量和組織形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果:免疫組織化學(xué)染色及掃描電鏡:正常組頂圈呈1排內(nèi)毛細胞,2-3排外毛細胞;中圈呈1排內(nèi)毛細胞,3排外毛細胞,內(nèi)外毛細胞排列規(guī)則,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加數(shù)量無明顯變化。DAPT組及DM組頂圈呈1排內(nèi)毛細胞,4-8排外毛細胞;中圈呈1排內(nèi)毛細胞,3-5排外毛細胞。Math1組頂圈呈1排內(nèi)毛細胞,3-4排外毛細胞,中圈呈1排內(nèi)毛細胞,3-5排外毛細胞,毛細胞排列規(guī)則。DM組頂圈呈1排內(nèi)毛細胞,4-8排外毛細胞,中圈呈1排內(nèi)毛細胞,3-5排外毛細胞,7天組和9天組在Math1組和DM組GER細胞處均可見少量異位的myosinVIIa陽性的細胞。而DAPT組和DM組隨著培養(yǎng)天數(shù)延長兩組的毛細胞數(shù)有增加趨勢,可見列外內(nèi)毛細胞,外毛細胞排列緊密不規(guī)則,皮板上靜纖毛發(fā)生轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。半薄切片:正常組呈1排內(nèi)毛細胞,3排外毛細胞;math1組呈1排內(nèi)毛細胞,4排外毛細胞;而DAPT組和DM組均見1排內(nèi)毛細胞,5排外毛細胞。 結(jié)論:1、DAPT能夠誘導(dǎo)基底膜頂圈產(chǎn)生大量額外的外毛細胞,可能導(dǎo)致毛細胞靜纖毛方向發(fā)生改變;2、過表達math1可誘導(dǎo)中圈GER處產(chǎn)生少量異位的毛細胞樣細胞;3、兩者合用既能使頂圈產(chǎn)生大量額外的外毛細胞又能使中圈GER處產(chǎn)生少量異位的毛細胞樣細胞,兩者具有累加效應(yīng)。
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【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R764

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉英鵬;鄢開勝;王建亭;龔樹生;;新生大鼠耳蝸Corti器體外培養(yǎng)及其轉(zhuǎn)基因表達[J];聽力學(xué)及言語疾病雜志;2006年02期

2 宣偉軍,丁大連;小鼠耳蝸毛細胞體外培養(yǎng)研究方法[J];中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志;2005年03期

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本文編號：2411393