【摘要】：研究背景 年齡相關(guān)性白內(nèi)障(Age-related cataract, ARC)是全球最主要致盲眼病之一[1]，其主要臨床表現(xiàn)為晶狀體發(fā)生混濁，且患者隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)生無痛性視力下降。隨著人口快速增長(zhǎng)和老齡化，ARC患者數(shù)量將日趨增加[2]；雖然白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)能給患者帶來較滿意視力效果，但不可避免的存在一些術(shù)后并發(fā)癥；同時(shí)日益增長(zhǎng)手術(shù)需求加重了社會(huì)經(jīng)濟(jì)問題，其巨額支出給國(guó)家及社會(huì)帶來了沉重的醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前研究認(rèn)為ARC為典型的多基因疾病，其發(fā)生發(fā)展與環(huán)境及遺傳等多種因素相關(guān)[3]。 真核細(xì)胞胞漿中的RNA顆粒被定義為由不同功能mRNA與蛋白質(zhì)組成的一種亞細(xì)胞單位復(fù)合體，其在轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控中起著十分重要的作用[4]。最新研究表明，RNA顆粒成分的TDRD7(Tudor domain containing protein7，TDRD7)基因與白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，且TDRD7突變會(huì)導(dǎo)致眾多已知與白內(nèi)障相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生明顯變化。其中與白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制相關(guān)的已知βB3晶狀體蛋白(βB3-crystallin，CRYBB3)與小分子熱休克蛋白1(small Heat shock protein1，HSPB1)可直接與TDRD7相結(jié)合。RNA顆粒成分TDRD7對(duì)維持晶狀體透明功能發(fā)揮著重要作用[5],但TDRD7與ARC的遺傳易感性及其在晶狀體功能中作用具體機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。 研究目的 采取功能候選基因策略在中國(guó)漢族人群中對(duì)TDRD7基因單核苷酸多態(tài)性與ARC易感性進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，并對(duì)ARC易感位點(diǎn)的功能機(jī)制進(jìn)行初步探討；同時(shí)對(duì)TDRD7介導(dǎo)的HSPB1/CRYBB3信號(hào)通路影響ARC發(fā)生的分子機(jī)制進(jìn)行初步研究。 研究方法 1.利用HAPMAP數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合生物信息學(xué)方法挑選具有潛在生物學(xué)效應(yīng)的TDRD7單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)。 2.按照統(tǒng)一的納入排除標(biāo)準(zhǔn)收集ARC患者及健康自愿者的外周靜脈血，抽提基因組DNA；采用SNaPshot方法進(jìn)行基因分型，分析TDRD7基因單核苷酸多態(tài)性在ARC患者及對(duì)照組之間基因型、等位基因頻率，以及與不同類型不同年齡階段的ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。 3.利用免疫組織化學(xué)方法觀察人類晶狀體TDRD7和HSPB1蛋白表達(dá)及定位；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在RNA水平上對(duì)不同年齡不同基因型的皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮組織TDRD7、HSPB1和CRYBB3表達(dá)情況進(jìn)行探討。同時(shí)采用Western Blot方法在蛋白水平上觀察不同年齡不同基因型的皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮組織HSPB1和CRYBB3表達(dá)變化。 研究結(jié)果： 1.利用HAPMAP數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合生物信息學(xué)分析在TDRD7基因及其上游7kb調(diào)控區(qū)域內(nèi)篩選出5個(gè)最小等位基因頻率(Minor Allele Frequency,MAF)大于10%的SNP位點(diǎn)作為研究對(duì)象。這5個(gè)位點(diǎn)分別為位于外顯子誘發(fā)錯(cuò)義突變的rs2045732及位于TDRD7上游調(diào)控區(qū)個(gè)的4個(gè)SNP位點(diǎn)(rs1462091,rs11793735,rs10981985,rs1462089)。 2.在符合納入排除標(biāo)準(zhǔn)的271例正常健康對(duì)照和218例ARC病例中，采用SNaPshot方法對(duì)篩選出的5個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，5個(gè)位點(diǎn)在病例及對(duì)照中均符合哈溫平衡。分析顯性、隱性、等位基因遺傳模式下各個(gè)SNP位點(diǎn)與ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性，結(jié)果提示rs10981985位點(diǎn)多態(tài)性與ARC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。其中rs10981985A等位基因顯著減低ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(pc=0.01，OR:0.619,95%CI:0.455-0.841),且GA和AA基因型個(gè)體ARC患病率顯著低于GG基因型個(gè)體(pc=0.02，OR:0.561,95%CI:0.388-0.809)。而其余4個(gè)位點(diǎn)與ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)均無顯著性差異(pc0.05)。 3.其次在不同類型白內(nèi)障患者中發(fā)現(xiàn)，rs10981985位點(diǎn)多態(tài)性與皮質(zhì)性ARC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)程度更高，即A等位基因降低皮質(zhì)性ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(pc=0.012，OR:0.502,95%CI:0.315-0.801)，GA和AA基因型個(gè)體皮質(zhì)性ARC發(fā)生率顯著低于GG基因型個(gè)體(pc=0.016，OR:0.431,95%CI:0.251-0.740);此外rs10981985GA和AA基因型個(gè)體混合性ARC患病率低于GG基因型個(gè)體(pc=0.048，OR:0.433,95%CI:0.235-0.797)。 4.以不同年齡層次將樣本劃分為65歲及≥65歲兩組，觀察在顯性、隱性、等位基因遺傳模式下rs10981985位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與ARC患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性，結(jié)果提示在≥65歲組人群中rs10981985單核苷酸多態(tài)性與ARC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，其中在≥65歲組人群中A等位基因顯著減低ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(pc=0.004， OR:0.476,95%CI:0.299-0.759),且AA基因型個(gè)體在≥65歲組人群中ARC患病風(fēng)險(xiǎn)顯著低于GG和GA基因型攜帶個(gè)體(pc=0.016，OR:0.086,95%CI:0.011-0.671)。 5.將皮質(zhì)性ARC患者以不同年齡層次將樣本劃分為65歲及≥65歲兩組，觀察在顯性、隱性、等位基因遺傳模式下rs10981985位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與皮質(zhì)性ARC患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性，結(jié)果顯示在≥65歲組人群中rs10981985位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與皮質(zhì)性ARC患病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。其中rs10981985A等位基因在≥65歲組人群中顯著減低皮質(zhì)性ARC患病風(fēng)險(xiǎn)(pc=0.004，OR:0.307,95%CI:0.140-0.674),在≥65歲組人群中AA和GA基因型個(gè)體皮質(zhì)性ARC患病風(fēng)險(xiǎn)顯著低于GG基因型個(gè)體(pc=0.028，OR:0.320,95%CI:0.136-0.755)。 6.在人類晶狀體上皮組織細(xì)胞漿以及晶狀體纖維細(xì)胞內(nèi)皮質(zhì)層TDRD7廣泛表達(dá)。熒光定量PCR結(jié)果顯示在皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞TDRD7的mRNA表達(dá)與年齡呈顯著線性負(fù)相關(guān)(r=-0.487，p=0.001)，而將樣本依據(jù)年齡劃分為兩組，≥65歲組的皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞TDRD7的mRNA表達(dá)水平顯著低于65歲患者(p=0.019)。在顯性、隱性、等位基因型遺傳模式下分析rs10981985位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性是否影響皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞TDRD7的mRNA表達(dá)，結(jié)果提示AA和GA基因型的皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞TDRD7基因mRNA表達(dá)高于GG基因型皮質(zhì)性ARC患者(p=0.001)。 7.HSPB1在人類晶狀體上皮細(xì)胞漿以及晶狀體纖維細(xì)胞內(nèi)皮質(zhì)層廣泛表達(dá)。在顯性、隱性、等位基因型遺傳模式下分析rs10981985位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性是否影響皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞HSPB1的mRNA及蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示AA基因型皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞HSPB1基因mRNA(p=0.006)及蛋白表達(dá)(p=0.045)低于攜帶GG和GA基因型皮質(zhì)性ARC患者。 8.CRYBB3基因在皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞的mRNA表達(dá)與年齡呈線性負(fù)相關(guān)（r=-0.337，p=0.031）。而將樣本依據(jù)年齡劃分為兩組，結(jié)果提示65歲組的晶狀體上皮細(xì)胞CRYBB3蛋白表達(dá)高于≥65歲組表達(dá)(p=0.001)。在顯性、隱性、等位基因型遺傳模式下分析rs10981985位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性是否影響皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞CRYBB3mRNA和蛋白表達(dá)，，結(jié)果顯示rs10981985位點(diǎn)未影響皮質(zhì)性ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞CRYBB3基因mRNA(p0.05)及蛋白表達(dá)(p0.05)。 研究結(jié)論： 1. TDRD7基因的rs10981985位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性在中國(guó)重慶地區(qū)漢族人群尤其是在≥65歲人群與ARC尤其是皮質(zhì)性ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，且突變A等位基因?yàn)锳RC發(fā)病的保護(hù)因素，其機(jī)制可能為起保護(hù)效應(yīng)A等位基因通過維持較高的TDRD7mRNA表達(dá)水平從而降低ARC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。 2.rs10981985單核苷酸多態(tài)性可能通過調(diào)節(jié)HSPB1表達(dá)影響皮質(zhì)性ARC發(fā)病機(jī)制。 3. TDRD7基因以及其他與白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制相關(guān)的重要基因共同調(diào)控HSPB1的表達(dá)可能為ARC發(fā)生的重要機(jī)制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R776.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 張士元;我國(guó)白內(nèi)障的流行病學(xué)調(diào)查資料分析[J];中華眼科雜志;1999年05期

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本文編號(hào)：2379036