【摘要】： 第一部分萘性白內障的氧化損傷機制及鈣蛋白酶Ⅱ在氧化損傷中的作用 目的通過萘性白內障氧化損傷及鈣蛋白酶活性的研究,并結合萘性白內障α晶狀體蛋白翻譯后修飾及分子伴娘活性的探討,揭示鈣蛋白酶Ⅱ在白內障氧化損傷中的作用及萘性白內障作為年齡相關性白內障的可靠性及可行性,為進一步的研究打下了基礎。 材料與方法30只150g雌性SD大鼠被隨機分成2組：對照組、萘組。每周進行裂隙燈照相及灰度分析；第9周實驗結束時進行血漿及晶狀體中還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)及細胞內外鈣離子的檢測；通過HPLC法進行晶狀體勻漿的蛋白分離獲得α晶狀體蛋白,將α晶狀體蛋白通過雙向電泳進一步分離,然后通過MALDI-TOF-TOF系統(tǒng)進行雙向電泳上位點的鑒定及翻譯后修飾分析；通過α晶狀體蛋白抑制βL-晶狀體蛋白凝聚反應實驗檢測a晶狀體蛋白的分子伴娘活性強弱,并通過酪蛋白的水解程度判斷鈣蛋白酶Ⅱ活性的變化。結果從第3周開始,萘組晶狀體皮質灰度明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01),萘組晶狀體核灰度值自第3周起亦稍微高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。第9周時,萘組晶狀體上皮細胞凋亡數(shù)明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)；萘組血漿及晶狀體中GSH水平低于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；而MDA明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；萘組細胞內外鈣離子水平明顯高于對照組,鈣蛋白酶活性明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。本研究通過蛋白質組學研究鑒定出了α晶狀體蛋白的氧化、乙酰化、磷酸化、氨基甲�；�、甲基化等翻譯后修飾,并且在萘組鑒定出了C-端斷裂位點；另外,我們的數(shù)據(jù)亦表明,萘組α晶狀體蛋白分子伴娘活性明顯降低,和對照組相比,差別具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。結論本研究相對系統(tǒng)的報道了萘性白內障大鼠大體及組織細胞學損傷及晶狀體蛋白的翻譯后修飾的變化,并通過鈣蛋白酶活性的研究證實了鈣蛋白酶Ⅱ的活性升高在萘性白內障的氧化損傷中起到重要作用,從而在一定程度上證明了萘性白內障是一種可靠的、可重復性較好的年齡相關性白內障模型,為進一步的研究打下了基礎。第二部分鈣蛋白酶Ⅱ在萘醌誘導的細胞氧化損傷中的作用及其分子機制研究 目的進一步探討氧化損傷條件下,鈣蛋白酶Ⅱ活性增強的原因及對晶狀體上皮細胞的影響。 材料與方法將永生性人晶狀體上皮細胞系SRAO1／04分三組：A組：對照組、B組：萘醌組、C組：萘醌+E64D組。分12小時、24小時、36小時三個時間點,流式細胞儀分析細胞凋亡情況；熒光探針DCFH-DA法檢測細胞中活性氧的變化；共聚焦顯微鏡觀察與分析氧化損傷對細胞內鈣的影響；免疫組化及Western blot法分析鈣蛋白酶Ⅱ在細胞內的分布與蛋白水平的表達,Real Time-PCR法檢測鈣蛋白酶Ⅱ在m RNA水平的表達；通過Western blot法分析作為鈣蛋白酶Ⅱ的底物的αB-晶狀體蛋白量的變化,間接反應鈣蛋白酶Ⅱ的活性。 結果三個時間點萘醌組及萘醌+E64D組晶狀體上皮細胞的凋亡率均明顯高于對照組,萘醌組晶狀體上皮細胞的凋亡率明顯高于萘醌+E64D組；除處理后的第12小時萘醌+E64D組細胞中活性氧水平與對照組無明顯差別外,其他兩個時間點萘醌組及萘醌+E64D組晶狀體上皮細胞中活性氧的水平明顯高于對照組,三個時間點,萘醌組晶狀體上皮細胞中活性氧的水平明顯高于萘醌+E64D組；除處理后的第12小時萘醌+E64D組細胞內的鈣離子濃度與對照組無明顯差別外,其他兩個時間點萘醌組及萘醌+E64D組細胞內的鈣離子濃度明顯于對照組,而三個時間點,萘醌+E64D組細胞內的鈣離子濃度略低于萘醌組；三個時間點,鈣蛋白酶Ⅱ蛋白質及mRNA水平的表達量為萘醌組萘醌+E64D組對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。而αB晶狀體蛋白的量的變化為對照組萘醌+E64D組萘醌組,差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01) 結論本研究進一步驗證了萘醌對晶狀體上皮細胞的氧化損傷在一定程度上與鈣蛋白酶Ⅱ表達量的增加及活性增強有關,而鈣蛋白酶抑制劑E64D可抑制鈣蛋白酶Ⅱ的表達及鈣蛋白酶的活性,從而對氧化損傷具有一定的保護作用。 第三部分液體純牛奶對萘性白內障的影響及作用機制研究 目的探討液體純牛奶對萘性白內障的影響及可能的作用機制。 材料與方法90只150g雌性SD大鼠被隨機分成6組：對照組、正常量牛奶組、過量牛奶組、萘組、萘加正常牛奶組、萘加過量牛奶組。每周進行裂隙燈照相及灰度分析,第9周實驗結束時進行血漿及晶狀體中的半乳糖、鈣離子、氧自由基(ROS)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)測量。 結果皮質灰度方面,從第3周開始,萘加過量牛奶組晶狀體皮質繞核區(qū)灰度明顯高于萘組,至實驗結束,萘加正常牛奶組繞核區(qū)灰度和萘組相比差別無統(tǒng)計學意義。從第8周開始,過量牛奶組皮質灰度稍過于對照組,至實驗結束,正常牛奶組晶狀體皮質灰度與對照組相比差別無明顯統(tǒng)計學意義。核灰度方面,至實驗結束,正常牛奶組及過量牛奶組與對照組之間及正常牛奶加萘組與萘組之間灰度差別無統(tǒng)計學意義。從第3周開始,萘加過量牛奶組晶狀體核灰度值高于其它各組。第9周時,過量牛奶組血漿及晶狀體中ROS略高于對照組,而正常牛奶組血漿及晶狀體中ROS水平與對照組相比差別無統(tǒng)計學意義；萘加過量牛奶組血漿及晶狀體中ROS明顯高于萘組,而萘加正常牛奶組血漿晶狀體中ROS水平與萘組相比差別無統(tǒng)計學意義。過量牛奶組血漿及晶狀體中GSH略低于對照組,而正常牛奶組血漿晶狀體中GSH水平與對照組相比差別無統(tǒng)計學意義；萘加過量牛奶組血漿及晶狀體中GSH明顯低于萘組,而萘加正常牛奶組血漿晶狀體中GSH水平與萘組相比差別無統(tǒng)計學意義。過量牛奶組血漿及晶狀體中MDA略高于對照組,而正常牛奶組血漿及晶狀體中MDA水平與對照組相比差別無統(tǒng)計學意義；萘加過量牛奶組血漿及晶狀體中MDA明顯高于萘組,而萘加正常牛奶組血漿晶狀體中MDA水平與萘組相比差別無統(tǒng)計學意義。過量牛奶組血漿中Ca2+濃度略高于對照組,但差異無明顯統(tǒng)計學意義(p=0.08),該組房水及晶狀體中Ca2+濃度與對照組相比差別亦無統(tǒng)計學意義；萘組血漿、房水及晶狀體Ca2+明顯高于對照組(p＜0.05)。 結論本研究通過灰度定量方法證實過量牛奶可以促進萘性白內障的發(fā)生發(fā)展,這種作用的機制可能與牛奶成分在體內代謝過程中產生過多的氧自由基有關。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R776.1

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本文編號：2370314