【摘要】：目的：探討炎癥因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)在真菌性角膜炎中的表達(dá)及其分子調(diào)控機(jī)制。 方法：采用基質(zhì)內(nèi)注射法建立小鼠真菌性角膜炎模型,以此作為大體水平的研究對(duì)象；獲取小鼠骨髓中性粒細(xì)胞,以此作為細(xì)胞水平的研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)分為四部分：(1)建立C57BL/6小鼠真菌性角膜炎模型,采用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察IL-1β在角膜組織的表達(dá),探索真菌性角膜炎時(shí)IL-1β的主要細(xì)胞來源；(2)獲取C57BL/6、TLR4-/-以及TRIF-/-小鼠中性粒細(xì)胞,與煙曲霉菌株共同培養(yǎng),采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和Western-blot法檢測(cè)IL-1β的表達(dá),探索真菌性角膜炎時(shí)經(jīng)典Signal1通路對(duì)IL-1β的調(diào)控作用；(3)建立C57BL/6、 NLRP3-/-、ASC-/-以及Caspase-1-/-小鼠真菌性角膜炎模型,獲取C57BL/6、 Dectin-1-/-、NLRP3-/-、ASC-/-以及Caspase-1-/-小鼠中性粒細(xì)胞,與煙曲霉菌共同培養(yǎng),采用ELISA和Western-blot法檢測(cè)IL-1β的表達(dá),探索真菌性角膜炎時(shí)經(jīng)典Signal2通路對(duì)IL-1β的調(diào)控作用；(4)建立C57BL/6、Caspase-1-/-小鼠真菌性角膜炎模型,獲取C57BL/6.TLR4-/-、TRIF-/-、Dectin-1-/-以及Caspase-1-/-小鼠中性粒細(xì)胞,與煙曲霉菌共同培養(yǎng),采用Western-blot法檢測(cè)IL-1β、Caspase-11和Caspase-1的表達(dá),探索真菌性角膜炎時(shí)Caspase-11對(duì)IL-1β的調(diào)控作用。 結(jié)果：(1)C57BL/6小鼠感染煙曲霉菌24h后,可見大量募集至角膜感染區(qū)域的中性粒細(xì)胞；所有能夠表達(dá)IL-1β的細(xì)胞中,92.2%的是中性粒細(xì)胞；中性粒細(xì)胞中能夠表達(dá)IL-1β的比例為85.4%。感染煙曲霉菌48h后,角膜區(qū)域出現(xiàn)較高比例的巨噬細(xì)胞；所有能夠表達(dá)IL-1β的細(xì)胞中,29.7%的是巨噬細(xì)胞；巨噬細(xì)胞中能夠表達(dá)IL-1β的比例為96.6%。(2)Signal1通路預(yù)激活后給予真菌刺激,C57BL/6小鼠中性粒細(xì)胞中pro-IL-1β的表達(dá)量明顯增加,未預(yù)激活而只單純給予真菌刺激,pro-IL-1β的表達(dá)量也明顯增加,但與有預(yù)激相比其增加幅度略少；TLR4-1/-或TRIF-/-小鼠的中性粒細(xì)胞被真菌刺激4h或18h后,pro-IL-1β的表達(dá)較未感染時(shí)明顯增多,但是與C57BL/6小鼠相比無明顯差異。(3)Dectin-1-/--小鼠或者給予sky阻斷劑的C57BL/6小鼠的中性粒細(xì)胞被真菌刺激4h后,pro-IL-1β的表達(dá)較C57BL/6小鼠明顯減少；建立C57BL/6、NLRP3-/-、ASC-/-以及Caspase-1-/-小鼠真菌性角膜炎模型24h后,C57BL/6、NLRP3-/-和ASC-/-小鼠角膜中pro-IL-1β和mature IL-1β的表達(dá)量無明顯差異,Caspase-1-/-小鼠角膜中pro-IL-1β的表達(dá)量無明顯差異,但是mature IL-1β的表達(dá)量明顯低于C57BL/6小鼠；NLRP3-/-和ASC-/-小鼠的中性粒細(xì)胞被真菌刺激4h后,pro-IL-1β和mature IL-1β的表達(dá)量與C57BL/6小鼠相比無明顯差異；Caspase-1-/-小鼠或者給予Caspase-1阻斷劑的C57BL/6小鼠的中性粒細(xì)胞被真菌刺激4h后,pro-IL-1β的表達(dá)量無明顯差異,但mature IL-1β的表達(dá)量明顯低于C57BL/6小鼠。(4)預(yù)先給予Caspase-11阻斷劑的C57BL/6小鼠真菌性角膜炎模型,建模24h后其角膜中pro-IL-1β的表達(dá)量無明顯差異,但是mature IL-1β的表達(dá)量明顯低于未給予阻斷劑的C57BL/6小鼠；給予Caspase-11阻斷劑的C57BL/6小鼠的中性粒細(xì)胞被真菌刺激4h后,pro-IL-1β的表達(dá)量無明顯差異,但mature IL-1β和mature Caspase-1的表達(dá)量明顯低于單純刺激組；隨著真菌刺激時(shí)間的延長,C57BL/6小鼠中性粒細(xì)胞內(nèi)Caspase-11的表達(dá)量逐漸增加；TLR4-/-以及TRIF-/-小鼠中性粒細(xì)胞被真菌刺激4h后,Caspase-11的表達(dá)量與C57BL/6小鼠無明顯差異；Dectin-1-/-小鼠中性粒細(xì)胞被真菌刺激4h后,pro-Caspase-11的表達(dá)量略少于C57BL/6小鼠,給予syk阻斷劑后C57BL/6小鼠中性粒細(xì)胞內(nèi)pro-Caspase-11的表達(dá)明顯低于未給予阻斷劑者。 結(jié)論：(1)IL-1β參與角膜抗真菌感染的固有免疫過程,中性粒細(xì)胞是該階段主要的細(xì)胞來源；(2)真菌感染引起IL-1β的生成可以不通過經(jīng)典Signal1通路的預(yù)激,TLR4/TRIF通路不參與pro-IL-1β的生成；(3)真菌感染時(shí)Dect in-1/syk通路參與IL-1β的生成,Caspase-1參與IL-1β由前體至成熟體的修飾,但炎性復(fù)合體NLRP3與ASC不參與IL-1β的生成；(4)Caspase-11通過調(diào)控Caspase-1由前體至成熟體的修飾過程進(jìn)而參與IL-1β的生成。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R772.21

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2364195