【摘要】：濾過性手術仍是目前眼壓不能控制的青光眼的主要治療手段。術后濾過通道的瘢痕化導致術后2年的手術失敗率達15%～25%。影響濾過通道瘢痕化的危險因素有多種,包括年輕人、濾過手術史、術前長期使用有防腐劑的滴眼液、伴葡萄膜炎、眼前段新生血管形成等病史。各種原因導致濾過手術失敗的共同點是濾過通道的成纖維細胞過度增殖,導致過度纖維化反應、瘢痕形成。其細胞學基礎就是在TGF-β為主的細胞因子介導下,成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞,并合成過量的膠原蛋白等細胞外基質。最近的研究發(fā)現(xiàn),p38 MAPK信號通道在成纖維細胞表型轉化過程中起著重要的作用。本研究初步觀察了抑制p38 MAPK信號通道對兔小梁切除術后纖維化反應的作用,說明p38MAPK信號通道可作為新的抗瘢痕化作用靶點；在體外培養(yǎng)了人Tenon's囊成纖維細胞,證實了p38 MAPK信號通道參與了TGF-β1誘導下的成纖維細胞向肌成纖維細胞分化；設計、合成了特異性沉默p38 MAPK表達的siRNA,初步探討了RNA干擾p38 MAPK信號通道對TGF-β1誘導下成纖維細胞增殖、表型轉化的抑制作用。 一、抑制p38 MAPK信號途徑對兔小梁切除手術后纖維化反應的作用 目的：觀察p38 MAPK抑制劑SB203580對兔小梁切除術后纖維化反應的作用。方法：將12只兔24眼隨機分為3組：A組(單純小梁切除術組)、B組(小梁切除術+SB203580組)、C組(小梁切除術+MMC組)。對各組進行裂隙燈顯微鏡觀察、眼壓檢查、濾過區(qū)結膜組織學和透射電鏡觀察、免疫組織化學法檢查濾過區(qū)α-SMA表達、Elisa檢測房水及濾過區(qū)結膜組織的α-SMA、纖維連接蛋白含量、熒光實時定量PCR檢測各組術區(qū)結膜組織ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表達。 結果：術后14天A組濾過泡血管化、瘢痕形成,B組濾過泡扁平彌散,C組濾過泡蒼白缺血狀、扁平彌散。不同時間點各組之間眼壓無明顯差異。濾過泡組織學及透射電鏡觀察檢查可見不同組間結膜上皮細胞、成纖維細胞和上皮下纖維組織形態(tài)不同。免疫組織化學法觀察見A組纖維組織間大量的棕黃色α-SMA陽性細胞,B、C組陽性細胞數(shù)量減少。Elisa檢測各組房水及結膜的α-SMA及FN的含量差異有統(tǒng)計學意義,熒光實時定量PCR檢測各組結膜組織ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表達差異有顯著性,各指標均為A組最高,B組次之,C組最低。 結論：p38 MAPK抑制劑SB203580能減輕兔小梁切除術后纖維化反應,抑制p38MAPK信號通道可作為新的抗瘢痕化途徑。二、體外培養(yǎng)人Tenon's囊成纖維細胞及誘導表型轉化 目的：體外培養(yǎng)和鑒定人Tenon's囊成纖維細胞(Human Tenon's Fibroblast, HTF),觀察TGF-β1誘導的HTF表型轉化特征。 方法：取材人Tenon's囊組織,組織貼塊法培養(yǎng)傳代。倒置顯微鏡觀察HTF形態(tài)特點,免疫組織化學法波形蛋白及角蛋白染色鑒定細胞來源,細胞計數(shù)法繪制生長曲線。Western Blot檢測TGF-β1刺激下的信號通道蛋白p38MAP、Smad2的變化,熒光實時定量PCR檢測肌成纖維細胞分化標志α-SMA、CTGF、COL1A2的nRNA表達,Elisa檢測α-SMA和纖維連接蛋白的含量,流式細胞儀檢測細胞凋亡。 結果：顯微鏡下可見細胞呈長梭形或多突起的星形,貼壁生長。免疫組織化學染色波形蛋白為陽性,角蛋白陰性。生長曲線表明培養(yǎng)第2-8天為對數(shù)生長期。TGF-β1刺激使p38 MAPK、Smad2信號通道活化,ACTA2、CTGF、COL1A2 mRNA表達增強,α-SMA和纖維連接蛋白的含量增加,細胞凋亡減少。 結論：通過人Tenon's囊組織貼塊培養(yǎng)可獲得生長穩(wěn)定、成分純凈的HTF。TGF-β1刺激可促使成纖維細胞增殖、分化,合成細胞外基質,p38 MAPK信號途徑參與了這個過程。 三、沉默p38 MAPK表達的siRNA對TGF-β1誘導下的人Tenon's囊成纖維細胞的作用 目的：設計合成p38 MAPK siRNA,篩選獲得高效、特異的siRNA,觀察沉默p38MAPK表達對TGF-β1誘導下的HTF增殖和表型轉化的抑制作用。 方法：設計、合成三對靶向p38 MAPK的siRNA,(?)日離子脂質體lipofectamine 2000轉染體外培養(yǎng)的HTF,采用Western blot測定p38 MAPK表達抑制情況,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,MTT法檢測細胞活力篩選出最佳siRNA。以篩選出來的siRNA體外轉染HTF,同時設對任何基因無作用的siRNA作為陰性對照。TGF-β1刺激下,Westernblot觀察p38MAPK、Smad2信號通道改變,熒光實時定量PCR檢測ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表達,Elisa檢測α-SMA和纖維連接蛋白的含量,MTT法測定細胞活力,原子力顯微鏡觀察細胞形態(tài)及超微結構。 結果：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3對p38 MAPK的抑制率分別為71.01%、68.65%、86.87%,與單純TGF-β1刺激的凋亡率差分別為2.01%、1.72%、3.59%。三種siRNA對細胞活力抑制作用差異無顯著性。轉染p38 MAPK siRNA-3后,TGF-β1誘導的p38MAPK的表達顯著降低,Smad2信號通道先下降后升高趨勢,差異具有顯著性：明顯減少了ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表達,降低了α-SMA、FN的濃度,差異有統(tǒng)計學意義。轉染后TGF-β1刺激的時間因素與ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表達存在交互作用,時間因素與α-SMA、FN的含量有交互作用,并且這種交互作用呈線性或二次項趨勢。轉染后TGF-β1刺激下的細胞活力被明顯抑制。RNA干擾p38 MAPK對成纖維細胞形態(tài)及超微結構有明顯影響。 結論：設計合成的三種siRNA均具有p38 MAPK基因沉默效果,其中以siRNA-3效果最佳。靶向沉默p38MAPK表達的siRNA能有效抑制TGF-β1誘導的HTF增殖和表型轉化。
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【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R779.6

【參考文獻】

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本文編號：2357236