【摘要】：目的 1.通過532nm二極管激光光凝Wistar大鼠角膜緣血管網,造成眼壓升高,評價該模型的穩(wěn)定性和可靠性。 2.觀察大鼠慢性高眼壓模型試驗眼RGCs和LGN神經元中HSP72的表達情況,與利用不同方法調節(jié)HSP72的表達水平相比較,了解HSP72表達改變后是否對RGCs和LGN具有保護作用。 3.觀察不同HSP72表達狀態(tài)下,試驗眼RGCs和LGN神經元中SAPK/JNK通路的活化情況；并與SAPK/JNK通路抑制劑sp600125的作用相比較,探討HSP72調控青光眼神經損傷的機制。 方法 1.使用532nm二極管激光光凝Wistar大鼠的角膜緣血管網。30只Wistar大鼠按光凝前,光凝后3天、7天、14天和28天5個不同時間點分為5組,每組6只,利用Tonopen-XL眼壓計于處死前測量眼壓；每組又分為2個亞組,第一個亞組大鼠3只,用于熒光金逆行標記視網膜神經節(jié)細胞并計數；第2個亞組大鼠3只,并通過HE染色觀察視網膜神經節(jié)細胞及外側膝狀體的形態(tài)學改變。 2.用腹腔注射硫酸鋅或槲皮素的方法誘導HSP72表達改變。動物分組：A組為高眼壓組,Wistar大鼠30只；B組為硫酸鋅注射組,Wistar大鼠30只,每2周重復注射一次；C組為槲皮素注射組,Wistar大鼠30只。上述三組分別于激光前和眼壓升高后3天、7天、14天和28天5個不同時間點取材；每個時間點6只大鼠,每個時間點又分為3個亞組,每個亞組2只大鼠；一個亞組用于熒光金逆行標記計數視網膜神經節(jié)細胞；一個亞組用于免疫組織化學染色檢測HSP72的表達水平；另一個亞組用于western blotting檢測HSP72的表達水平。 3.用側腦室注射sp600125抑制SAPK/JNK的活化。對20只大鼠行側腦室sp600125注射,注射完畢后行激光；分別于激光前和眼壓升高后3天、7天、14天和28天5個不同時間點進行檢測；每個時間點4只大鼠,每個時間點又分為2亞組,每亞組2只大鼠；第一亞組用于熒光金逆行標記計數視網膜神經節(jié)細胞；第二亞組用于western blotting檢測p-JNK,p-c-jun的表達情況。 結果 1.通過532nm二極管激光光凝損傷角膜緣血管網成功建立了大鼠慢性青光眼模型,激光處理前試驗眼平均眼壓為13.34±0.52mmHg,空白對照眼平均眼壓為13.16±0.3 mmHg；激光處理后3天,7天,14天和28天,試驗眼平均眼壓分別為22.04±1.08 mmHg,28.84±1.38 mmHg,30.58±1.15 mmHg和：30.56±1.01mmHg；對照眼平均眼壓無明顯變化。激光處理前試驗眼與對照眼眼壓差異無統計學意義(P=0.54),激光處理后各時間點試驗眼較對照眼平均眼壓明顯升高,差異有極顯著統計學意義(P0.01)。隨著高眼壓持續(xù)時間的延長,視網膜神經節(jié)細胞逐漸出現胞體空泡化,胞核固縮,核碎裂以及細胞溶解；神經纖維層和內外核層逐漸變薄,內外核層核排列紊亂,數目減少。長時間的高眼壓會引起外側膝狀體神經元胞體水腫,胞核固縮,軸突減少以及軸突走向紊亂。視網膜鋪片RGCs計數平均為：眼壓升高前197.42±63.78個/視野,眼壓升高后3d組169.5±64.71個/視野,眼壓升高后7天組138.25±34.71個/視野,眼壓升高后14天組113.08±39.63個/視野,眼壓升高后28天組99.42±27.27個/視野；對照眼RGCs計數為：眼壓升高前198±63.17個/視野,眼壓升高后3天組194.67±64.14個/視野,眼壓升高后7天組196.67±67.90個/視野,眼壓升高后14天組194.83±69.6個/視野,眼壓升高后28天組199.42±27.27個/視野；激光處理后各時間點試驗眼RGCs計數較對照眼明顯減少(P0.05)。 2.眼壓升高前,試驗眼視網膜組織中未檢測到顯著的HSP72的表達；眼壓升高3天后RGCs中HSP72的表達達高峰,14天仍然可檢測到HSP72的表達,28天后基本下降到稍高于正常眼的表達；眼壓升高3天后,LGN神經元中也可以檢測到HSP72的表達,但表達高峰較RGCs晚,大約在7天達高峰,28天亦回到基線水平；硫酸鋅注射組RGCs和LGN神經元各時間點HSP72的表達均高于試驗眼；槲皮素注射組RGCs和LGN神經元各時間點HSP72的表達均顯著低于試驗眼。視網膜鋪片RGCs計數平均為：硫酸鋅注射組,眼壓升高前198.83±70.07個/視野,眼壓升高后3天組173.75±58.44個/視野,眼壓升高后7天組146.92±31.8個/視野,眼壓升高后14天組129.67±29.49個/視野,眼壓升高后28天組120±24.8個/視野；槲皮素注射組,眼壓升高前199.58士66.44個/視野,眼壓升高后3天組163.5士67.57個/視野,眼壓升高后7天組120.92士47.12個/視野,眼壓升高后14天組96.25士42.82個/視野,眼壓升高后28天組80.75士44.7個/視野。激光處理前各時間點之間RGCs計數差異無統計學意義(P0.05)；激光處理后各時間點,空白對照組,試驗組,硫酸鋅注射組和槲皮素注射組四組兩兩比較皆有顯著差異(p0.05)。 3.試驗組,硫酸鋅注射和sp600125注射組外側膝狀體神經元均可檢測到SAPK/JNK信號通路中p-JNK和其下游的p-c-jun表達的增高；三組p-JNK的表達在各個時間點沒有顯著差異(P0.05)；而硫酸鋅注射組和sp600125注射組高眼壓眼視神經投射的外側膝狀體區(qū)的p-c-jun表達,較試驗組高眼壓眼有明顯的下降(p0.05)。sp600125注射組RGCs平均計數為：眼壓升高前199.58士66.44個/視野,眼壓升高后3天組178.5士37.65個/視野,眼壓升高后7天組156.92士37.32個/視野,眼壓升高后14天組136.34士52.67個/視野,眼壓升高后28天組134.75士54.2個/視野；各時間點sp600125注射組RGCs計數均高于硫酸鋅注射組,差異有統計學意義(p0.05)。 結論 1.經532nm二極管激光光凝損傷角膜緣血管網引起眼壓升高可建立慢性青光眼模型,能夠造成明顯的視網膜神經節(jié)細胞損傷和丟失；并可引起LGN神經元的損傷。 2.眼壓升高和硫酸鋅腹腔注射會誘導RGCs和外側膝狀體神經元HSP72表達上調,硫酸鋅誘導的HSP72高表達可減少RGCs的死亡率。 3.HSP72在RGCs和外側膝狀體神經元中通過阻斷凋亡通路SAPK/ JNK的活化,發(fā)揮對青光眼視網膜神經路神經元的保護作用。
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【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R775

【參考文獻】

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本文編號：2341368