【摘要】：角膜緣區(qū)是角膜緣干細胞(limbal stem cells, LSCs)的所在之處,也是角結膜間重要的屏障結構,對角膜透明性的維持和正常生理功能的發(fā)揮具有重要的作用。嚴重的眼表疾病可損傷角膜緣區(qū),導致LSCs的缺失及屏障結構的破壞,從而引起一系列眼表反應,甚至導致失明。目前,LSCs移植是主要的治療方法。但LSCs供體的匱乏使其應用受到限制。組織工程角膜緣移植物有望為這一問題的解決提供新的思路,其是將體外培養(yǎng)的種子細胞接種于支架材料上所構建的與天然角膜緣植片結構和功能較為相似的組織替代物。充足的種子細胞和適宜的支架材料是組織工程角膜緣移植物構建的兩大關鍵。 角膜上皮暴露于眼表易于受損,理想的LSCs替代來源應有較強的自我更新能力。胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)因其所具有的強大增殖能力和分化全能性可作為一種良好的種子細胞來源,為組織工程植物物提供無限的細胞供給�，F(xiàn)階段國內外ESCs定向誘導在眼表研究方面多關注于終末角膜上皮細胞的分化,但角膜上皮細胞的增殖分化潛能有限。因此如能將ESCs在體外分化為增殖能力更強的LSCs樣細胞,可為組織工程角膜緣移植物的構建提供更為理想的種子細胞來源。 角膜緣區(qū)獨特的組織結構及基底膜成分是LSCs特性維持的重要基礎。人角膜緣基質是構建組織工程角膜緣植片的最佳支架材料,但同樣受到供體來源匱乏的限制。近年來,天然生物材料因其與正常組織近似的結構特性及成分構成,成為組織工程領域的研究熱點。本實驗室前期研究證實：0.5%十二烷基磺酸(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)脫細胞法可完全脫除豬角膜中的細胞成分,并保存角膜基質正常的膠原排列與基底膜結構。脫細胞豬角膜緣基質(acellular porcine limbal matrix, APLM)保留了角膜緣基質特有的三維結構,可用于角膜緣基質缺損的修補。但APLM能否作為良好的LSCs體外擴增載體及移植負載材料仍需進一步的研究。 因此,本研究首先探討了將人ESCs定向誘導分化為LSCs樣細胞的可行性,并篩選優(yōu)化了誘導方案,誘導細胞具有與人LSCs相似的形態(tài)及表型,增殖能力良好,可進一步分化為角膜上皮細胞樣細胞；其次通過分析APLM基底膜成分,證實APLM可支持人LSCs的粘附生長及干細胞特性的維持,可作為良好的LSCs體外擴增載體及移植負載材料；最后,我們利用人ESCs來源LSCs樣細胞聯(lián)合APLM構建了組織工程LSCs移植物,并進行了初步的動物移植實驗,結果顯示構建物在重建角膜緣結構及修復損傷眼表方面具有一定的作用。 第一部分人胚胎干細胞誘導分化為角膜緣干細胞樣細胞的實驗研究 [目的]探討體外誘導人ESCs定向分化為LSCs樣細胞的可行性并篩選優(yōu)化誘導方案。 [方法] 1.人ESCs的培養(yǎng)及鑒定：將絲裂霉素C處理過的胚鼠成纖維細胞按5×104細胞/cm2密度接種于35mm細胞培養(yǎng)皿內備用。于解剖顯微鏡下將人ESCs克隆團分割成小塊,按100個克隆團／皿接種于胚鼠成纖維細胞飼養(yǎng)層上,常規(guī)培養(yǎng)；每6天機械法傳代。利用免疫細胞熒光檢測人ESCs標記物OCT-4和SSEA-3的表達。 2.人LSCs的原代培養(yǎng)及鑒定：將絲裂霉素C處理過的3T3鼠成纖維細胞按2.4×104細胞/cm2密度接種于35mm細胞培養(yǎng)皿內備用。無菌條件下去除人角膜緣環(huán)殘余結膜和葡萄膜組織,撕去角膜內皮。將剩余組織塊置于2.4U/mldispaseⅡ內37℃消化1.5小時,刮取角膜緣上皮,0.25%胰酶-0.02%EDTA消化10分鐘,使用DMEM/F12配制的LSCs培養(yǎng)基(DMEM/F12-LSCs培養(yǎng)基)或MCDB151配制的LSCs培養(yǎng)基(MCDB151-LSCs培養(yǎng)基)重懸細胞,按5×103細胞/cm2密度接種于3T3飼養(yǎng)層細胞上,常規(guī)培養(yǎng),隔日給予新鮮的DMEM/F12-LSCs培養(yǎng)基或MCDB151-LSCs培養(yǎng)基。利用免疫細胞熒光檢測人LSCs標記物p63α、ABCG-2和角膜上皮細胞標記物CK12的表達。 3.條件培養(yǎng)基的配制：待LSCs克隆團邊緣開始融合時,按200μL/cm2分別加入新鮮DMEM/F12-LSCs培養(yǎng)基或MCDB151-LSCs培養(yǎng)基,每24小時收集細胞培養(yǎng)上清液,連續(xù)5天,將收集好的上清液用0.22μm濾器過濾后-80℃保存?zhèn)溆�。將收集的培養(yǎng)基上清液與同種新鮮LSCs培養(yǎng)基分別按照3：1,1：1和1：3的比例混合配制成上清液濃度分別為75%,50%和25%的DMEM/F12-LSCs條件培養(yǎng)基或MCDB151-LSCs條件培養(yǎng)基,4℃保存?zhèn)溆�。收集單獨培養(yǎng)3T3細胞的DMEM/F12-LSCs培養(yǎng)基上清液與MCDB151-LSCs培養(yǎng)基上清液與同種新鮮LSCs培養(yǎng)基按照1：1比例混合配制成DMEM/F12-3T3條件培養(yǎng)基及MCDB151-3T3條件培養(yǎng)基,作為對照使用。 4.人ESCs的定向誘導及標記物的鑒定：機械法分割人ESCs克隆團,移入35mmm低粘附細胞培養(yǎng)皿內采用擬胚體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)5天,即獲得球形的擬胚體。將擬胚體接種于預包被Ⅳ性膠原的35mm細胞培養(yǎng)皿內,分別給予配置好的不同濃度的條件培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)12天。根據所加入條件培養(yǎng)基的種類及濃度不同,分別將誘導細胞命名為75%DMEM/F12-LSCs條件培養(yǎng)基組(75DF),50%DMEM/F12-LSCs條件培養(yǎng)基組(50DF),25%DMEM/F12-LSCs條件培養(yǎng)基組(25DF),75%MCDB151-LSCs條件培養(yǎng)基組(75M),50%MCDB151-LSCs條件培養(yǎng)基組(50M),25%MCDB151-LSCs條件培養(yǎng)基組(25M),及DMEM/F12-3T3條件培養(yǎng)基組(DF-3T3)、MCDB151-3T3條件培養(yǎng)基組(M-3T3)。利用實時定量聚合酶鏈式反應和免疫細胞熒光檢測各組誘導細胞內p63α、ABCG-2及CK12的表達,篩選優(yōu)化誘導方案。 5、誘導細胞克隆形成能力及分化水平的檢測：將誘導細胞接種于3T3飼養(yǎng)層上,每隔10天進行傳代,直至鏡下觀察無明顯克隆團形成為止。利用Giemsa染色法檢測不同代間誘導細胞的克隆形成能力。利用免疫細胞熒光比較不同代間誘導細胞內p63α、ABCG-2及CK12的表達情況。 [結果] 人ESCs與原代人LSCs均可在飼養(yǎng)層上形成克隆團樣結構,并表達各自特征性的細胞標記物。誘導實驗結果顯示：更換條件培養(yǎng)基24小時后,擬胚體即貼壁生長。75DF組內細胞逐漸轉變?yōu)槎噙呅紊掀蛹毎?大小形態(tài)均一,呈鋪路石樣,9天后局部可見復層細胞結構。MCDB151-LSCs條件培養(yǎng)基組自第9天起克隆團邊緣出現(xiàn)類神經樣細胞,細胞形態(tài)出現(xiàn)差異,差異性隨條件培養(yǎng)基濃度降低而增高。實時定量聚合酶鏈式反應和免疫細胞熒光檢測結果表明誘導細胞于第9天出現(xiàn)ABCG-2、p63α表達高峰,其中75DF組表達量明顯高于其余各組；誘導前9天CK12表達量維持較低水平,12天時開始升高。免疫細胞熒光計數(shù)顯示75%DMEM/F12-LSCs條件培養(yǎng)基的誘導效率最高,培養(yǎng)9天時,約80%的誘導細胞表達ABCG-2,超過40%的細胞呈p63α陽性。體外擴增實驗顯示誘導細胞可連續(xù)傳代4代以上。隨傳代次數(shù)增加,細胞內CK12表達上調,呈角膜上皮細胞表型。 [結論] 通過條件培養(yǎng)基體外模擬角膜緣微環(huán)境,可將人ESCs誘導分化為LSCs樣細胞。 第二部分脫細胞豬角膜緣基質的制備及生物學特性檢測 [目的] 探討APLM作為人LSCs體外擴增載體及移植負載材料的可行性。 [方法] 1. APLM及APCM的制備：無菌條件下切取新鮮豬角鞏膜緣(含1mm鞏膜,2mm外周角膜)及中央角膜(直徑7.5mm)組織,置于0.5%SDS溶液中4℃脫細胞24小時。無菌磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)漂洗脫細胞組織16小時,去除SDS。切取含前彈力層的脫細胞角鞏膜緣基質及脫細胞角膜基質(厚約0.5mm),即獲得APLM與APCM支架。 2.脫細胞羊膜(denuded amniotic membrane, DAM)的制備：無菌條件下將新鮮羊膜修剪成5cm×5cm的小塊,上皮面朝上平鋪于無菌乙酸纖維素薄膜,置于1：1的甘油-DMEM溶液中-144℃冰箱保存。使用前于室溫解凍水化30分鐘,加入0.25%胰酶-0.02%EDTA37℃消化1h后,小心刮除羊膜上皮細胞,根據需要修剪大小,即為DAM支架。 3.支架材料的形態(tài)學及免疫學檢測：HE染色及DAPI染色檢測APLM、APCM及DAM支架材料中細胞脫除情況。采用免疫組織熒光方法分析比較APLM、 APCM、DAM及正常人角膜緣基底膜中collagen Ⅳ a2, laminin β1, perlecan, agrin, laminin a2, lamininγ3, tenascin-C的表達情況。 4.組織工程LSCs植片的構建及其形態(tài)功能的檢測：將APLM、APCM及DAM置于DMEM/F12-LSCs培養(yǎng)基內37℃浸泡24小時,基底膜面向上置于24孔板內。將生長狀態(tài)良好的人LSCs消化離心制成細胞懸液,按細胞密度1.5×103細胞/mm2接種于APLM、APCM及DAM表面,待細胞貼壁后補足培養(yǎng)基至支架表面被浸沒。常規(guī)培養(yǎng)21天后,通過HE染色檢測組織形態(tài),利用免疫組織熒光檢測及實時定量聚合酶鏈式反應檢測接種細胞內ABCG-2、p63α及CK12的表達。 [結果] HE染色及DAPI染色顯示APLM、APCM及DAM支架中未見細胞成分殘留,材料內膠原排列及基底膜結構保留完好。免疫組織熒光檢測表明人角膜緣組織、APLM及DAM基底膜均高表達collagen Ⅳα2、laminin β1、perlecan及agrin;APCM基底膜中可見perlecan高表達,collagen IV a2和lamininβ1微弱表達,未觀察到agrin表達。人角膜緣區(qū)基底膜特異性標記物laminin α2、laminin γ3和tenascin-C在APLM基底膜均高表達；APCM和DAM內未觀察到三者的表達。接種LSCs在APLM、APCM及DAM表面均可形成排列緊密的復層上皮細胞樣結構。APLM上可見4-5層細胞-底層細胞呈矮柱狀,排列緊密,表層細胞呈扁平狀,與正常角膜緣細胞結構近似。接種細胞于APCM上可形成2-3層細胞,底層未見矮柱狀細胞。DAM上擴增的細胞達5-6層,細胞體積較大,排列緊密,表層為扁平狀細胞,基底部無明顯矮柱狀細胞。免疫組織熒光檢測證實APCM及DAM上的細胞廣泛表達CK12,但ACBG-2及p63α表達較弱。APLM上擴增的細胞：基底部細胞層高表達ABCG-2及p63α, CK12表達則多集中于表層細胞。實時定量聚合酶鏈式反應檢測顯不APLM接種細胞內p63α、ABCG-2的表達量約為DAM或APCM接種細胞的2倍, CK12的表達量僅為后兩者的40%。 [結論] APLM基底膜具有與人角膜緣基底膜相似的成分構成,可良好支持人LSCs的體外擴增及干細胞特性的維持。 第三部分脫細胞豬角膜緣基質聯(lián)合人胚胎干細胞來源角膜緣干-細胞構建角膜緣移植物修復損傷眼表的初步研究 [目的] 探討人ESCs來源LSCs樣細胞聯(lián)合APLM構建角膜緣移植物,重建角膜緣微環(huán)境及修復損傷眼表的可行性。 [方法] 1.組織工程角膜緣移植物的構建：采用75%DMEM/F12-LSCs條件培養(yǎng)基誘導人ESCs9天,將誘導細胞按細胞密度1.5×103細胞/mm2接種于APLM及DAM表面。常規(guī)培養(yǎng)21天,通過HE染色檢測植片組織形態(tài)。 2.組織工程角膜緣移植物的移植實驗：采用角膜緣干細胞組織切除聯(lián)合角膜上皮化學燒傷法建立LSCs失代償動物模型,即用3%戊巴比妥鈉麻醉實驗用兔,板層切除角膜緣組織,正-庚醛去除中央角膜上皮,1月后根據角膜混濁、新生血管及熒光素染色情況對損傷眼表進行評分,各項評分≥2者,即為LSCs失代償。將15只LSCs失代償兔,隨機分為3組,每組5只。A組：移植人ESCs來源LSCs聯(lián)合APLM構建的組織工程植片；B組：移植人ESCs來源LSCs聯(lián)合DAM構建的組織工程植片；C組：移植APLM支架材料。術后每日給予典必殊眼水3次,典必殊眼膏1次,定期裂隙燈下觀察眼表修復情況,1月后行病理檢查。 [結果] 誘導細胞可于APLM及DAM表面形成4-5層細胞,細胞排列緊密,APLM復層細胞結構中底層細胞呈矮柱狀,表層細胞則呈扁平狀。移植術后1周,各組球結膜充血明顯,角膜混濁水腫。術后2周,A、B組炎癥反應減輕,角膜水腫有所消退,B組可見羊膜降解；C組角膜仍明顯水腫。移植術后1個月,A組角膜透明度明顯改善,熒光素染色陰性,僅角膜緣區(qū)可見少量新生血管；B組角膜透明度有所改善,熒光素染色陰性,可見少量新生血管長入；C組角膜新生血管及角膜混濁明顯,角膜結膜化,熒光素染色陽性。HE染色顯示A組角膜上皮結構完整；B組上皮結構中可見部分空泡狀杯狀細胞；C組則未見連續(xù)角膜上皮結構。 [結論] 人ESCs來源LSCs樣細胞聯(lián)合APLM構建的角膜緣移植物在重建角膜緣結構及修復損傷眼表方面具有一定的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R779.65

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本文編號：2316641