發(fā)布時間：2018-10-12 20:57

【摘要】：第一部分：人高分化喉鱗狀細胞癌細胞系FD-LSC-1的建立此部分研究旨在通過采集喉癌標本組織直接進行原代細胞培養(yǎng)來建立一株新的能夠代表近年來中國喉癌喉人群部分發(fā)病機制及生物學(xué)特征的喉鱗狀細胞癌細胞系。本研究中,我們嘗試收集了2011年6月-2011年12月在我院確診為喉鱗狀細胞癌的40位患者的喉癌組織標本,其中會厭癌29例,聲門癌8例,頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)3例,均為男性患者,年齡46-68歲。將收集的標本組織在24小時之內(nèi)進行洗滌、消毒、機械剪碎及膠原酶消化后直接進行原代細胞培養(yǎng)或組織塊培養(yǎng),對生長出的喉癌上皮細胞進行傳代、純化、流式細胞儀及免疫熒光純度測定、定期凍存、支原體污染檢測及復(fù)蘇活性測定。同時采集癌旁正常上皮組織進行同法原代培養(yǎng),作為腫瘤細胞的對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：喉癌組織或細胞在體外直接進行原代培養(yǎng)比較困難,細菌及真菌污染和癌細胞不貼壁是培養(yǎng)過程中的主要問題,即使貼壁生長,絕大多數(shù)不超過3代。從40例喉癌標本中我們僅成功建立了一株新的喉鱗狀細胞癌細胞系,命名為FD-LSC-1,來自于一位未經(jīng)治療的分化良好的會厭鱗癌伴雙頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(IVa, T4aN2M0)的68歲男性患者的會厭病灶,該患者沒有喉癌家族史,但有40余年的吸煙史及30余年的飲酒史。FD-LSC-1細胞在體外傳代超過100代,癌細胞已純化,沒有支原體污染,凍存后復(fù)蘇的FD-LSC-1細胞活性良好。癌旁正常上皮也成功培養(yǎng)傳代到第8代。以上結(jié)果表明：人喉鱗癌FD-LSC-1細胞系已經(jīng)初步建立達永生化；喉鱗癌原代細胞在體外較難成活和培養(yǎng)建系,可能與喉癌病灶大多原發(fā)于有菌腔道且與空氣、消化液或痰液接觸有關(guān)；成功建立能夠在體外穩(wěn)定生長和連續(xù)傳代的喉鱗癌細胞系是一項艱苦的工作,需要經(jīng)過多次嘗試和多次失敗才能偶獲成功。第二部分：人高分化喉鱗狀細胞癌細胞系FD-LSC-1的鑒定此部分研究旨在對新建立的喉鱗癌FD-LSC-1細胞系進行進一步鑒定,包括三部分內(nèi)容：首先是種屬鑒定,確認FD-LSC-1細胞系是人來源的；其次是細胞組織來源鑒定,確認FD-LSC-1細胞系是上皮組織細胞來源的；最后是惡性生物學(xué)特征的鑒定,確認FD-LSC-1細胞系是惡性腫瘤。本研究中,首先利用目前最權(quán)威的短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)圖譜技術(shù)對FD-LSC-1細胞系的17個短串聯(lián)重復(fù)序列基因座及一個性別決定基因座(Amelogenin)進行了檢測分析,通過美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection, ATCC)對檢測結(jié)果進行了種屬鑒定,并與美國ATCC及歐洲微生物和細胞培養(yǎng)物收藏中心(DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)中的遺傳信息進行比對,檢測有無被現(xiàn)存的任何細胞系污染；其次,利用相差顯微鏡觀察FD-LSC-1細胞的形態(tài),利用免疫熒光法檢測FD-LSC-1細胞廣譜角蛋白及波形蛋白的表達情況,利用透射電鏡技術(shù)檢查上皮超微結(jié)構(gòu)；最后,對FD-LSC-1細胞系進行了惡性生物學(xué)特征的鑒定,包括：吉姆薩(Giemsa)染色形態(tài)學(xué)觀察、透射電鏡癌細胞超微結(jié)構(gòu)檢查、染色體組核型分析、流式細胞儀DNA倍體分析、軟瓊脂集落形成能力檢測及免疫缺陷小鼠致瘤能力的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：首先,美國ATCC的檢測報告確認FD-LSC-1細胞系是人來源的細胞系,并且沒有受到美國ATCC及歐洲D(zhuǎn)SMZ細胞庫中任何細胞系的污染。其次,相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細胞呈鵝卵石樣單層貼壁生長,胞漿內(nèi)常可見空泡,與人喉表皮樣癌HEp-2細胞系的多邊形不同；細胞免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細胞為廣譜角蛋白陽性而波形蛋白陰性；透射電鏡檢查發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細胞之間可見橋粒,胞漿內(nèi)可見張力絲等上皮超微結(jié)構(gòu)。最后,對FD-LSC-1細胞系進行的惡性生物學(xué)特征檢測發(fā)現(xiàn)：Giemsa染色的FD-LSC-1細胞核分裂像明顯活躍,胞核大,核漿比例增大,可見巨核細胞；透射電鏡癌細胞超微結(jié)構(gòu)檢查發(fā)現(xiàn)FD-LSC-1細胞胞漿內(nèi)線粒體、核糖體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富：染色體組核型分析提示FD-LSC-1細胞系存在明顯的數(shù)量異常和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)異常,染色體眾數(shù)為68,為近3倍體,結(jié)構(gòu)異常包括染色體增加、缺失及易位等；流式細胞儀DNA倍體及細胞周期分析發(fā)現(xiàn),與宮頸癌Hela細胞系相比,FD-LSC-1細胞系G0/G1期比例下降,S期比例增高,而G2/M期比例類似；FD-LSC-1細胞系未能夠在半固體軟瓊脂培養(yǎng)基中形成集落；FD-LSC-1細胞能夠順利在免疫缺陷小鼠皮下形成移植瘤,移植瘤HE(hematoxylin eosin)染色病理提示為高分化鱗癌。以上結(jié)果表明：經(jīng)過種屬、組織來源及惡性生物學(xué)特征的鑒定,新建立的FD-LSC-1細胞系符合癌細胞系所必需的各項生物學(xué)特征,可以確認是人喉上皮組織來源的高分化鱗癌細胞系,且沒有被目前存在的任何細胞系污染。第三部分：人高分化喉鱗狀細胞癌細胞系FD-LSC-1的特征分析此部分研究旨在對已經(jīng)過鑒定的人高分化喉鱗癌FD-LSC-1細胞系進行個性化的特征分析,包括：體外培養(yǎng)群體倍增時間、遷移侵襲潛能、放化療敏感性、Notchl及EGFR (epidermal growth factor receptor)通路、CK(cytokeratin) 5及Ki67的蛋白水平、TP53基因突變、人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染、頭頸鱗癌相關(guān)分子標記物檢測、頭頸鱗癌相關(guān)失調(diào)基因檢測及頭頸鱗癌相關(guān)失調(diào)microRAN檢測,為FD-LSC-1細胞系貼上個性化的特征標簽。本研究中,利用CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒對FD-LSC-1細胞系進行了體外培養(yǎng)的群體倍增時間測定,以Hela細胞系為對照利用包被基質(zhì)膠的Transwell小室對FD-LSC-1細胞系進行了遷移及侵襲能力的檢測,再以Hela細胞系為對照利用X射線及順鉑對FD-LSC-1細胞系進行了放化療敏感性的檢測,利用Western Blot技術(shù)對FD-LSC-1細胞系的Notch、EGFR、CK5及Ki67的蛋白水平進行了檢測,利用基因測序技術(shù)對FD-LSC-1細胞系TP53抑癌基因的全部外顯子進行了突變檢測,利用兩對通用引物結(jié)合PCR (polymerase chain reaction)技術(shù)對FD-LSC-1細胞系的HPV感染情況進行了檢測,利用免疫組化和免疫熒光技術(shù)對FD-LSC-1細胞系的頭頸鱗癌相關(guān)重要分子標記進行了檢測,利用SYBR Green實時熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR,quantitative rael-time polymerase chain reaction)對FD-LSC-1細胞系的頭頸鱗癌相關(guān)失調(diào)基因進行了檢測以及利用TaqMan探針qRT-PCR技術(shù)對FD-LSC-1細胞系頭頸鱗癌相關(guān)失調(diào)miRNA進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：FD-LSC-1細胞系在體外培養(yǎng)的群體倍增時間約為24小時,FD-LSC-1細胞系比Hela細胞具有更強的遷移及侵襲潛能但對放化療相對更敏感,FD-LSC-1細胞系具有激活的Notchl和EGFR信號通路以及上調(diào)的CK5和Ki67蛋白水平, FD-LSC-1細胞系TP53基因第5和8外顯子分別發(fā)生了錯義突變和無義突變,FD-LSC-1細胞系沒有被HPV感染,FD-LSC-1細胞系表達ADAM10及MLH1等重要的頭頸鱗癌相關(guān)分子標記物,SYBR Green qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了FD-LSC-1細胞系有TERT等14個頭頸鱗癌相關(guān)上調(diào)基因及KRT4等14個下調(diào)基因,TaqMan探針qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了FD-LSC-1細胞系有miRNA-21等9個頭頸鱗癌相關(guān)上調(diào)miRNA及miRNA-138等10個下調(diào)miRNA。以上結(jié)果表明：經(jīng)過對已鑒定的人高分化喉鱗癌FD-LSC-1細胞系進行倍增時間等9項個性化的生物學(xué)特征分析之后,FD-LSC-1細胞系已經(jīng)被建立、鑒定及較好地特征化,為進一步有針對性地利用FD-LSC-1細胞系對我國喉鱗癌人群的發(fā)病機制及腫瘤生物學(xué)特性進行研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.65

【參考文獻】

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本文編號：2267574