【摘要】：目的和意義 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國南方及東南亞地區(qū)常見的一種惡性腫瘤,其發(fā)病與愛波斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr Virus, EBV)感染、化學促癌物和/或致癌物以及遺傳因素密切相關(guān),但迄今為止,鼻咽癌發(fā)病的分子機制尚未完全闡明。流行病學研究發(fā)現(xiàn),鼻咽癌的發(fā)病具有民族、地域和家族聚集現(xiàn)象,其患者在3號染色體短臂最常發(fā)生連續(xù)性、非隨機性等位基因雜合子缺失(loss of heterozygosity, LOH),其中3p14～21、3p21.3～22和3p25-26是原發(fā)性鼻咽癌LOH高頻區(qū),且3號染色體短臂的遺傳學改變常發(fā)生在鼻咽部上皮細胞表型發(fā)生異常和EBV感染之前,是鼻咽癌發(fā)生過程中的極早期事件。因此,在3號染色體短臂尋找鼻咽癌相關(guān)的未知基因?qū)τ诮沂颈茄拾┌┳冊缙诘姆肿訖C制具有重要的意義。 MicroRNA (miRNA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類大小約為19～25個核苷酸(nucleotide, nt)的非編碼單鏈小分子RNA,由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的大小約為70～100nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)過Dicer酶剪切加工后生成,通過與靶基因mRNA的3,非編碼區(qū)(3'untranslated region,3'UTR)互補匹配導致該mRNA的降解。大多數(shù)miRNA與底物mRNA不完全配對結(jié)合,通過轉(zhuǎn)錄后抑制翻譯來調(diào)控基因表達。miRNA基因以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組中,而且絕大部分定位于基因間隔區(qū),其轉(zhuǎn)錄獨立于其他基因,并不翻譯成蛋白質(zhì),而是在體內(nèi)代謝過程中發(fā)揮多種調(diào)控作用,包括動植物的組織器官發(fā)育、細胞分化和凋亡、胰島素分泌、脂肪代謝等多種生命活動,其表達失調(diào)將導致重大疾病,如腫瘤的發(fā)生。 正常細胞的生長、增殖、發(fā)育、分化和死亡是一個高度有序的過程,而腫瘤的形成正是這一高度有序的過程發(fā)生紊亂所造成的,其發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多階段、多因素參與的復雜過程,這一過程涉及到多個基因在時間和空間上的協(xié)調(diào)表達。除了蛋白編碼基因,最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤的發(fā)病機制中發(fā)揮舉足輕重的作用。miRNA作為一類新型基因調(diào)控劑,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明,50%以上的miRNA定位在腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域,包括LOH區(qū)、染色體擴增區(qū)及脆性位點等,其表達水平在多種腫瘤中發(fā)生改變,通過調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,影響癌細胞的增殖、分化、凋亡、運動、浸潤、轉(zhuǎn)移以及血管生成等生物學特性,發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用,多角度多層次的參與了腫瘤的演進。 miR-26a首先從Hela細胞克隆得到,全長22nt,在多種組織泛表達,其表達無組織特異性。值得注意的是,miR-26a定位在3p22,此區(qū)域恰好為鼻咽癌LOH高頻區(qū),也是克隆鼻咽癌候選抑癌基因的關(guān)鍵位點。miR-26a的基因組定位引起了我們的強烈興趣和極大關(guān)注。目前研究發(fā)現(xiàn),miR-26a的表達失調(diào)參與了抵御病原微生物入侵的天然免疫應答、器官組織的發(fā)育分化以及多種實體瘤和造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病機制等各種生物學過程。而令人費解的是,miR-26a在不同腫瘤的發(fā)病機制中扮演了截然相反的雙重角色。在淋巴瘤、乳腺癌以及肝癌中,miR-26a在癌組織中表達降低,并發(fā)揮抑癌基因的作用；而在膠質(zhì)瘤中,miR-26a卻表達增高,扮演癌基因的角色。然而,迄今為止,鼻咽癌中關(guān)于miR-26a功能的相關(guān)研究卻鮮有報道。那么,鼻咽癌患者3p發(fā)生LOH是否引起miR-26a的表達失調(diào), miR-26a的表達失調(diào)在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中又扮演著何種角色及其分子機理等一系列問題都值得我們深入探討。 基于miR-26a的研究現(xiàn)狀及其在鼻咽癌癌變早期分子機制中的潛在意義,本課題的研究目的為明確miR-26a在鼻咽癌細胞和組織中的表達特性,探討miR-26a對鼻咽癌細胞生物學特性的影響及其在鼻咽癌發(fā)病機制中所發(fā)揮的重要作用,闡明miR-26a在鼻咽癌中發(fā)揮生物學功能的分子機理,為深入理解鼻咽癌發(fā)病的分子機制和尋找新的分子靶向治療靶點奠定理論基礎(chǔ)。 材料和方法 1.細胞培養(yǎng) 人鼻咽癌細胞株5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、C666-1、HONE1和HNE-1采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基,NP69采用KMSF培養(yǎng)基,293T細胞采用DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng),細胞生長狀態(tài)良好時用于實驗。 2.臨床標本收集 18例鼻咽癌組織和16例鼻咽慢性炎組織均來源于南方醫(yī)院耳鼻喉科標本庫,所有標本均為鼻咽部活檢組織,經(jīng)病理學檢查確診,鼻咽癌組織學分型為非角化性未分化型鱗癌,所有患者均尚未接受放化療治療。本研究經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者均簽署知情同意書。 3.載體構(gòu)建 [1]慢病毒載體pLVTHM/miR-26a:該載體經(jīng)慢病毒包裝、感染細胞后可穩(wěn)定過表達miR-26a,由本人在南方醫(yī)科大學腫瘤研究所攻讀碩士學位期間構(gòu)建成功。 [2] pGL3-EZH2 wt 3'UTR和pGL3-EZH2 mut 3'UTR:以正常人外周血基因組DNA為模板,擴增EZH2 3'UTR (264bp),將該片段克隆到pGL3-control vector,得到重組質(zhì)粒pGL3-EZH2 wt3'UTR,然后將該重組質(zhì)粒進行定點突變,得到突變質(zhì)粒pGL3-EZH2 mut3'UTR。 [3] Lenti-EZH2和Lenti-shEZH2:該慢病毒表達載體可分別過表達和穩(wěn)定干擾EZH2,由香港中文大學醫(yī)學院陳楊超教授惠贈。 4.慢病毒包裝、濃縮及滴度測定 采用磷酸鈣沉淀法,將慢病毒表達載體(穿梭載體)和慢病毒包裝載體(psPAX2和pMD2.G)共轉(zhuǎn)染293T細胞,培養(yǎng)48～72h后收集病毒上清,超速離心進行濃縮純化,倍比稀釋進行滴度測定。 5.細胞轉(zhuǎn)染 [1] miRNA瞬時轉(zhuǎn)染：采用陽離子脂質(zhì)體法進行瞬時轉(zhuǎn)染,操作按LipofectamineTM 2000試劑說明書進行。6孔板中miRNA的轉(zhuǎn)染量為100nM。 [2]慢病毒感染：將慢病毒懸液按照不同的病毒感染復數(shù)感染鼻咽癌細胞,48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光(green fluorescent protein, GFP)發(fā)光情況。鑒于慢病毒感染效率較高,以GFP為標記,利用流式細胞儀進行細胞分選獲得GFP陽性細胞,分別建立過表達miR-26a、過表達EZH2、穩(wěn)定干擾EZH2的鼻咽癌細胞株。 [3] miRNA與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染：操作按LipofectamineTM 2000試劑說明書進行。24孔板中miRNA的轉(zhuǎn)染量為50nM,重組質(zhì)粒pGL3-EZH2 wt3'UTR和pGL3-EZH2 mut 3'UTR的轉(zhuǎn)染量為100ng,內(nèi)對照pRL-SV40質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染量為5ng。 6.熒光定量PCR 抽提細胞和組織的總RNA和小分子RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,采用sybrgreen法進行PCR擴增,通過相對定量以2-ΔΔCt值代表基因的相對表達強度。 7. Western blot 抽提細胞總蛋白,采用BCA法進行蛋白濃度測定,然后10% SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交、顯影及定影,蛋白相對表達強度采用Quantity One軟件進行定量。 8.雙熒光素酶活性檢測將熒光素酶報告基因載體瞬時轉(zhuǎn)染36h后,將細胞裂解,然后利用GloMaxTM 96 Microplate Luminometer發(fā)光檢測儀分別測定Firefly luciferase和Renilla luciferase活性。共轉(zhuǎn)pRL-SV40質(zhì)粒作為內(nèi)對照用來校正轉(zhuǎn)染效率,以Firefly luciferase與Renilla luciferase活性的比值作為熒光素酶的相對活性,進行不同樣品間的比較。 9.細胞生物學實驗 [11 MTT實驗：將1x103個細胞接種于96孔板中,每孔體積200μl,每組5孔,同時設(shè)空白對照,分別培養(yǎng)1、2、3和4天。每孔加入5mg/ml的MTT20μl,37℃培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基,加入二甲基亞砜150μl,室溫孵育10min,使結(jié)晶物充分溶解,以空白對照孔調(diào)零,酶標儀上490nm測定各孔吸光度值(OD值),以相對應OD比值表示細胞增殖能力大小。 [21平板克隆形成實驗：接種200個細胞到6孔板中,保證細胞分散均勻,培養(yǎng)2周。出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆時,終止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)基,甲醇固定后結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計數(shù)形成的克隆數(shù)(≥50個細胞為一個克隆)。平板克隆形成率=形成克隆數(shù)/接種細胞數(shù)x100%。 [3]細胞周期檢測：采用碘化丙錠(propidium iodide, PI)單染法檢測細胞周期分布。將細胞固定、Rnase A消化、PI染色后,流式細胞儀檢測。 10.動物實驗 分別將過表達miR-26a的C666-1/miR-26a和對照組細胞C666-1/con隨機接種于10只裸鼠后背部皮下,接種細胞數(shù)為5×105,每組包括5只。每兩天用游標卡尺測量腫瘤的長短徑一次,按如下公式計算腫瘤體積：v=(D×d2)/2,其中D代表腫瘤最長徑,而d代表腫瘤最短徑。待腫瘤體積超過500mm3,將實驗動物處死,腫瘤組織取出后經(jīng)福爾馬林固定,石蠟包埋,切片后HE染色,光學顯微鏡觀察。 11.免疫組化 將石蠟切片進行脫蠟、抗原修復、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、抗體孵育、DAB顯色、復染、透明、封片等步驟進行,免疫組化的檢測結(jié)果進行半定量判定。隨機選取5個高倍視野,如果核陽性的腫瘤細胞數(shù)超過50%,則認為該樣本陽性。然后,按照細胞染色強度進行評分：棕褐色3分,棕黃色2分,淡黃色1分,無著色0分。 12.統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。MTT實驗和動物實驗皮下成瘤體積的比較采用析因設(shè)計的方差分析；免疫組化染色強度的比較采用Mann-Whitney U檢驗；鼻咽癌組織中miR-26a和EZH2表達水平的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)；其他實驗中涉及到兩組數(shù)據(jù)之間的比較均采用兩獨立樣本的t檢驗,而三組或三組以上數(shù)據(jù)的比較均采用單因素方差分析,其多重比較采用SNK法。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果 1.鼻咽癌中miR-26a表達特性的鑒定 熒光定量PCR結(jié)果顯示,在7種鼻咽癌細胞株,即5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、C666-1、HONE1和]HNE-1,miR-26a的表達均低于永生化鼻咽上皮細胞NP69(F=8.875,P0.001);而在18例非角化未分化型鼻咽癌組織中,miR-26a的平均表達水平比16例鼻咽慢性炎組織降低60%(t=-6.976,P0.001)。上述實驗結(jié)果表明,miR-26a在鼻咽癌細胞和組織中表達下調(diào),為進一步研究其生物學功能提供了初步依據(jù)。我們推測,3p LOH可能是引起鼻咽癌中miR-26a表達下調(diào)的最重要機制,尚有待進一步證實。 2. miR-26a過表達對鼻咽癌細胞生物學特性的影響 選取未分化鼻咽癌細胞株C666-1和低分化細胞株HNE-1作為細胞模型,研究miR-26a表達改變對鼻咽癌細胞生物學特性的影響。首先,瞬時轉(zhuǎn)染miR-26a mimic和inhibitor?熒光定量PCR檢測miR-26a表達的改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在C666-1和HNE-1中轉(zhuǎn)染miR-26a mimic后,miR-26a的表達分別增高了4.99(t=-9.650,P=0.001)和5.47倍(t=-11.307,P0.001)；而轉(zhuǎn)染anti-miR26a后,miR-26a的表達分別降低了85%(t=8.175,P=0.001)和80% (t=8.143,P=0.001)。該結(jié)果顯示,瞬時轉(zhuǎn)染miR-26a mimic和antimiR-26a可有效上調(diào)或下調(diào)miR-26a的表達。 隨后,通過MTT實驗和細胞周期檢測觀察miR-26a表達改變對鼻咽癌細胞增殖能力的影響。MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-26a mimic 96h后,C666-1和HNE-1細胞的生長速度分別降低了42%(t=21.682,P0.001)和45%(t=26.662,P0.001)；而轉(zhuǎn)染anti-miR26a 96h后,兩種細胞的生長速度分別加快了55%(t=-40.993,P0.001)和47%(t=-28.592,P0.001)。細胞周期分布顯示,miR-26a過表達使C666-1細胞G1期細胞比例顯著增高22%(t=-15.128,P0.001),而S比例顯著降低(t=13.173, P0.001), G2+M期細胞比例無顯著改變；而干擾miR-26a抑制其表達,細胞周期分布無顯著差異(P0.05)。該結(jié)果表明,miR-26a過表達通過誘導細胞周期G1期阻滯,抑制鼻咽癌細胞增殖。 在此結(jié)果的基礎(chǔ)上,通過構(gòu)建miR-26a漫病毒表達載體,病毒包裝濃縮,以不同的感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI),分別感染C666-1和HNE-1細胞,熒光定量PCR檢測miR-26a的表達,從而確定慢病毒感染鼻咽癌細胞的最佳MOI。結(jié)果表明,當MOI=100時,miR-26a的表達在C666-1和HNE-1中分別增高了9.46倍(F=152.822,P0.001)和10.83倍(F=152.871,P0.001),差異具有顯著性,故后續(xù)實驗采用MOI=100作為最佳感染復數(shù)。依據(jù)慢病毒載體所攜帶的GFP標記,采用流式細胞儀分選(fluorescence activated cell sorter, FACS)獲得GFP陽性細胞群,建立穩(wěn)定過表達miR-26a的鼻咽癌細胞株C666-1/miR-26a和HNE-1/miR-26a。 利用該細胞株,通過平板克隆形成實驗檢測了miR-26a過表達對癌細胞克隆形成能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-26a過表達使C666-1和HNE-1細胞的克隆形成率分別降低44%(t=25.154,P0.001)和42%(t=-22.321,P0.001)。MTT實驗和細胞周期檢測的結(jié)果與瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)果相一致,即miR-26a過表達通過誘導G1期阻滯抑制癌細胞增殖。此外,我們還將C666-1/miR-26a細胞接種裸鼠皮下,建立鼻咽癌異位移植瘤模型,進一步研究miR-26a過表達對鼻咽癌細胞體內(nèi)成瘤能力的影響。結(jié)果表明,接種后第9天成瘤能力出現(xiàn)顯著性差異,C666-1/miR-26a細胞所形成的腫瘤體積顯著小于對照細胞(t=-6.649,P0.001)。至第15天,接種C666-1/miR-26a細胞形成的腫瘤體積比對照組細胞的腫瘤體積降低45%(t=-15.605,P0.001),且免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-26a過表達后顯著降低了Ki-67和PCNA的表達(P0.05)。 以上結(jié)果顯示,miR-26a參與了鼻咽癌的發(fā)病機制,其表達失調(diào)與鼻咽癌細胞的體外增殖和體內(nèi)成瘤能力密切相關(guān),在鼻咽癌中扮演候選抑癌基因角色。 3. miR-26a抑制鼻咽癌細胞增殖相關(guān)分子機理的探討 利用miRBase、TargetScan和miRanda三大數(shù)據(jù)庫對miR-26a進行靶基因預測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個數(shù)據(jù)庫均預測組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2 (Enhancer ofZeste Homolog 2)為miR-26a的靶基因,且得分較高,結(jié)果可靠。在生物信息學預測的基礎(chǔ)上,推測EZH2可能是miR-26a的靶基因。于是,我們構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGL3-wt EZH2 3'UTR和突變質(zhì)粒pGL3-mut EZH2 3'UTR,以便進行雙熒光酶報告基因?qū)嶒灐⑸鲜鲋亟M質(zhì)粒和miR-26a mimic、anti-miR26a共轉(zhuǎn)染C666-1細胞,檢測熒光素酶活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)pGL3-wt 3'UTR和miR-26a mimic共轉(zhuǎn)染可顯著降低熒光素酶的活性(t=-13.026,P0.001),而將該重組質(zhì)粒與antimiR-26a共轉(zhuǎn)染后可顯著增強熒光素酶的活性(t=-8.370,P=0.001),表明miR-26a與EZH23'UTR可特異性結(jié)合。 隨后,通過采用5個不同的MOI,觀察miR-26a不同程度過表達對EZH2表達的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在C666-1細胞中,miR-26a過表達可顯著抑制EZH2mRNA (F=88.649, P0.001)和蛋白水平的表達,且呈劑量依賴性,即miR-26a過表達程度越高對EZH2的抑制作用越明顯,在HNE-1細胞中也獲得類似的結(jié)果(F=442.510,P0.001)。相反,沉默miR-26a后可顯著上調(diào)EZH2 mRNA和蛋白的表達(P0.001)。此外,我們還檢測了鼻咽癌組織中EZH2的表達,結(jié)果顯示EZH2在鼻咽癌組織中表達上調(diào),其平均表達是水平慢性鼻咽炎組織的2.12倍(t=-5.818,P0.001),且EZH2 mRNA的表達與miR-26a在同一組鼻咽癌組織中呈負相關(guān)(r=-0.874,P0.001)。以上結(jié)果證實,在鼻咽癌中EZH2為miR-26a的靶基因。 在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上,又分別過表達和干擾EZH2,觀察EZH2表達改變對鼻咽癌細胞增殖能力的影響。MTT實驗結(jié)果表明,在實驗第4天,EZH2沉默后使C666-1細胞的增殖能力降低41%(F=612.085,P0.001),與miR-26a過表達引起類似的抑制作用。而細胞周期檢測的結(jié)果同樣顯示,干擾EZH2與過表達miR-26a均可誘導G1期阻滯(F=223.443,P0.001)。隨后,我們在C666-1/miR-26a細胞中進一步過表達EZH2,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染96h后EZH2過表達可顯著逆轉(zhuǎn)miR-26a的增殖抑制作用,使細胞的生長速度趨于正常(F=1078.465,P0.001),使G1期細胞比例顯著降低(F=360.732,P0.001)。該結(jié)果表明,miR-26a抑制鼻咽癌細胞增殖的生物學功能是通過調(diào)控EZH2的表達來實現(xiàn)的。 眾所周知,miRNA功能的發(fā)揮是通過調(diào)控成百上千個靶基因所構(gòu)成的龐大網(wǎng)絡來實現(xiàn)的,因此,為了深入解析miR-26a發(fā)揮功能的分子機理,我們進一步檢測了C666-1細胞中p53和pRb信號通路以及c-myc等一系列細胞周期調(diào)控因子的表達。結(jié)果表明,miR-26a過表達和EZH2沉默均可抑制CCND3、CCNE2、CDK4、CDK6和c-myc,同時上調(diào)p14ARF和p21CIP1,而對CCND1、CCNE1、CDK2、p16INK4A、p53和pRb的表達無影響。此外,EZH2過表達還可逆轉(zhuǎn)miR-26a對上述基因的抑制作用。我們還發(fā)現(xiàn)miR-26a過表達可抑制CCND2,而EZH2對該基因并無調(diào)控作用,提示該基因可能為miR-26a在鼻咽癌中的另一靶基因。綜合以上結(jié)果,闡明了miR-26a參與鼻咽癌發(fā)病的分子機理,即通過調(diào)控靶基因EZH2,進一步影響G1/S關(guān)鍵點相關(guān)調(diào)控因子的表達,從而引起G1期阻滯抑制鼻咽癌細胞增殖。 結(jié)論 1. miR-26a在鼻咽癌細胞株和組織中表達下調(diào)。 2. miR-26a參與了鼻咽癌的發(fā)病機制,其表達失調(diào)影響癌細胞的體外增殖和體內(nèi)成瘤能力,發(fā)揮候選抑癌基因的功能。 3.在鼻咽癌中,EZH2為miR-26a的靶基因。 4. miR-26a通過調(diào)控靶基因EZH2,進一步影響細胞周期相關(guān)調(diào)控因子的表達,從而誘導G1期阻滯抑制鼻咽癌細胞增殖。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R739.63

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7 潘建基;;鼻咽癌規(guī)范化治療—鼻咽癌診療指南解讀[A];2007第六屆全國放射腫瘤學學術(shù)年會論文集[C];2007年

8 楊興龍;申洪;宗永生;;鼻咽癌及癌旁組織超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)定量研究[A];首屆粵港生物物理學術(shù)研討會論文集[C];1999年

9 林貴山;李永青;程惠華;;首周開始放療時間對鼻咽癌療效的影響[A];2007第六屆全國放射腫瘤學學術(shù)年會論文集[C];2007年

10 夏云飛;劉秀芳;賀玉香;蔣昌斌;仲萍萍;嚴珊珊;劉莉;曾木圣;劉強;蘇勇;劉蕙;曹素梅;易煒;劉巧丹;陳小章;;鼻咽癌放射敏感性及其預后指標的研究[A];中華醫(yī)學會放射腫瘤治療學分會六屆二次暨中國抗癌協(xié)會腫瘤放療專業(yè)委員會二屆二次學術(shù)會議論文集[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 本報記者　房琳琳;曾益新：八年抗戰(zhàn)“鼻咽癌”[N];科技日報;2006年

2 鄭靈巧;廣西鼻咽癌防治研究現(xiàn)場建立30年[N];健康報;2007年

3 姚琳;廣西鼻咽癌防治研究得到國際認可[N];廣西日報;2007年

4 本報記者 劉偉盛邋通訊員 歐陽作憲;鼻咽癌 廣西人不必談之色變[N];南寧日報;2007年

5 本報記者 李穎;鼻咽癌為何會在廣東高發(fā)？[N];科技日報;2009年

6 李蘭陵　肖蔻;早診早治遠離鼻咽癌[N];中國中醫(yī)藥報;2009年

7 ;講白話廣東人最易患鼻咽癌[N];廣州日報;2003年

8 本報記者 黃R，

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