【摘要】：目的：探討Toll樣受體(TLR)介導(dǎo)的胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)及其下游信號分子OX40L/OX40在過敏性結(jié)膜炎中的作用機(jī)制。 方法：本研究建立了三種不同類型的過敏模型,據(jù)此,實驗分以下三部分進(jìn)行。1.花粉誘導(dǎo)的小鼠的過敏性結(jié)膜炎模型：取野生型BALB/C小鼠,TLR4基因缺陷鼠；基于C57BL/6的Myd88+/+和Myd88-/-小鼠；分別在建模第一天給予花粉的全身致敏,在第10-15天進(jìn)行花粉的局部眼表直接刺激。應(yīng)用qPCR,免疫組織化學(xué)染色,免疫熒光檢測小鼠角膜上皮,結(jié)膜上皮,頸部致敏淋巴結(jié)中TSLP,其下游相關(guān)因子及Th2細(xì)胞因子的表達(dá)。2.花粉誘導(dǎo)的小鼠局部眼表TSLP誘發(fā)模型：取野生型BALB/C小鼠,TLR4基因缺陷鼠；基于C57BL/6的Myd88+/+和Myd88-/-小鼠；直接給予花粉進(jìn)行眼表的局部刺激4-24小時。應(yīng)用qPCR和ELISA檢測小鼠的角膜和結(jié)膜上皮中TSLP的表達(dá)變化。3.花粉誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞TSLP誘發(fā)模型：體外培養(yǎng)人的角膜上皮細(xì)胞,分別給予不同濃度的花粉刺激,以及TLR4抗體,NF-K b-I的預(yù)處理,應(yīng)用qPCR和ELISA檢測TSLP的表達(dá)變化。 結(jié)果：1.花粉誘導(dǎo)的小鼠的過敏性結(jié)膜炎模型： ①在BALB/C小鼠的過敏性結(jié)膜炎模型中,qPCR顯示：與PBS對照組相比,模型鼠角膜上皮,結(jié)膜上皮和頸部致敏淋巴結(jié)中TSLP, TSLP下游通路因子(TSLPR,OX40L,OX40, CD11C, CD4)以及Th2細(xì)胞因子(IL-4. IL-5, IL-13)表達(dá)增加,而Thl細(xì)胞因子IFNγ表達(dá)量則基本不變。免疫組織化學(xué)染色在蛋白水平證實了這一變化。 ②在BALB/C小鼠和TLR4基因缺陷鼠的過敏模型中,qPCR顯示：與BALB/C小鼠過敏模型對照組相比,TLR4基因缺陷模型鼠角膜上皮,結(jié)膜上皮和頸部致敏淋巴結(jié)中TSLP, TSLP下游通路因子以及Th2細(xì)胞因子表達(dá)量降低。對模型鼠眼球的免疫組織化學(xué)染色和淋巴結(jié)的免疫熒光染色在蛋白水平證實了這一變化。 ③在Myd88+/+小鼠的過敏性結(jié)膜炎模型中,qPCR顯示：與Myd88++PBS對照組相比,模型鼠角膜上皮,結(jié)膜上皮和頸部致敏淋巴結(jié)中TSLP, TSLP下游通路因子以及Th2細(xì)胞因子表達(dá)增加。與Myd88-/-過敏模型相比,這些細(xì)胞因子的表達(dá)也明顯高于Myd88-/-小鼠的過敏性模型組。對模型鼠眼球的免疫組織化學(xué)染色和淋巴結(jié)的免疫熒光染色在蛋白水平證實了這些變化。 2.花粉誘導(dǎo)的小鼠局部眼表TSLP誘發(fā)模型： 1)與PBS對照組相比,BALB/C小鼠眼表接受花粉直接刺激后,其角膜上皮和結(jié)膜上皮中TSLP表達(dá)量增加。給予TLR4抗體的預(yù)處理可以抑制花粉對TSLP的刺激作用。TSLP表達(dá)量的ELISA檢測在蛋白水平證實了這些變化。 2)與BALB/C小鼠花粉刺激組相比,TLR4基因缺陷刺激組角膜上皮,結(jié)膜上皮中TSLP表達(dá)量降低。與Myd88+/+小鼠花粉刺激組相比,Myd88-/-花粉刺激組角膜上皮,結(jié)膜上皮中TSLP表達(dá)量也同樣是降低的。TSLP表達(dá)量的ELISA檢測在蛋白水平證實了這些變化。 3.花粉誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞TSLP誘發(fā)模型： 在體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞中,花粉可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞中TSLP表達(dá)量增加,并呈現(xiàn)出濃度依賴的變化趨勢。給予TLR4抗體或者NF-K b-I可以抑制花粉對TSLP的刺激作用。TSLP表達(dá)量的ELISA檢測在蛋白水平證實了這些變化。 結(jié)論：1.TSLP及其下游通路因子在過敏性結(jié)膜炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。 2.在花粉誘導(dǎo)的過敏性結(jié)膜炎中,外界致敏原可以通過TLR4/Myd88這一信號通路,誘導(dǎo)上皮細(xì)胞中TSLP及其相關(guān)信號分子的表達(dá),進(jìn)而誘發(fā)Th2炎癥反應(yīng)。 3.人為阻斷TLR4, Myd88等關(guān)鍵位點,可以抑制花粉誘導(dǎo)的過敏反應(yīng),降低TSLP及相關(guān)Th2細(xì)胞因子的表達(dá),從而可能成為臨床上新的治療靶點。
[Abstract]:AIM: To investigate the role of Toll-like receptor (TLR)-mediated thymic stromal lymphopoietin (TSLP) and its downstream signal molecule OX40L/OX40 in allergic conjunctivitis.
Methods: Three different types of allergic models were established in this study. The experiment was divided into three parts. 1. Pollen-induced conjunctivitis in mice: wild-type BALB/C mice, TLR4 gene-deficient mice, Myd88+/+ and Myd88-/-mice based on C 57BL/6, and whole-body sensitization with pollen on the first day of the model, respectively. Pollen-induced TSLP expression in corneal epithelium, conjunctival epithelium and cervical sensitized lymph nodes was detected by qPCR, immunohistochemical staining and immunofluorescence. 2. Pollen-induced TSLP induction model of local ocular surface in mice: wild-type BALB/C mice, TLR4 Gene-deficient mice; Myd88+/+and Myd88-/-mice based on C57BL/6; local eye surface stimulation with pollen was performed for 4-24 hours directly. The expression of TSLP in corneal and conjunctival epithelium of mice was detected by qPCR and ELISA. 3. Pollen-induced TSLP induction model of human corneal epithelial cells: human corneal epithelial cells were cultured in vitro and given to the mice respectively. The expression of TSLP was detected by qPCR and ELISA after different concentrations of pollen stimulation and pretreatment with TLR4 antibody and NF-K b-I.
Results: 1. pollen induced allergic conjunctivitis models in mice:
(1) In BALB/C mice with allergic conjunctivitis, the expression of TSLP, TSLP downstream pathway factors (TSLPR, OX40L, OX40, CD11C, CD4) and Th2 cytokines (IL-4.IL-5, IL-13) in corneal epithelium, conjunctival epithelium and cervical sensitized lymph nodes were increased, while the expression of Thl cytokine IFN-gamma was increased, compared with PBS control group. The immunohistochemical staining confirmed this change at the protein level.
(2) In BALB/C mice and TLR4-deficient mice, the expression of TSLP, TSLP downstream pathway factors and Th2 cytokines in corneal epithelium, conjunctival epithelium and cervical sensitized lymph nodes of TLR4-deficient mice were decreased by qPCR compared with BALB/C mice. Immunofluorescence staining of chromatic and lymph nodes confirmed this change at protein level.
(3) The expression of TSLP, TSLP downstream pathway factors and Th2 cytokines in corneal epithelium, conjunctival epithelium and cervical sensitized lymph nodes in Myd88 + / + mice were increased by qPCR compared with Myd88 + + PBS control group. The expression of these cytokines was also significantly higher than that in Myd88 - / - allergic model. Immunohistochemical staining of the eyeballs and immunofluorescence staining of the lymph nodes of the model mice at protein level confirmed these changes.
2. pollen induced local ocular surface TSLP induced model in mice:
1) Compared with PBS control group, the expression of TSLP in corneal epithelium and conjunctival epithelium of BALB/C mice increased after direct pollen stimulation. Pretreatment with TLR4 antibody inhibited the stimulation of pollen to TSLP. These changes were confirmed at protein level by ELISA.
2) Compared with BALB/C mice, TSLP expression in corneal epithelium and conjunctival epithelium was decreased in TLR4 deficient stimulation group. Compared with Myd88+/+ mice, TSLP expression in corneal epithelium and conjunctival epithelium was also decreased in Myd88-/-pollen stimulation group. Change.
3. pollen induced TSLP model of human corneal epithelial cells:
In cultured human corneal epithelial cells, the expression of TSLP was induced by pollen in a concentration-dependent manner. TLR4 antibody or NF-K b-I inhibited the stimulation of pollen on TSLP. These changes were confirmed at protein level by ELISA.
Conclusion: 1.TSLP and its downstream pathway factors play an important role in the pathogenesis of allergic conjunctivitis.
2. In allergic conjunctivitis induced by pollen, the external allergens can induce the expression of TSLP and related signaling molecules in epithelial cells through the TLR4/Myd88 signaling pathway, and then induce Th2 inflammation.
3. Artificial blockade of TLR4, Myd88 and other key sites can inhibit pollen-induced allergic reactions, reduce the expression of TSLP and related Th2 cytokines, which may become a new therapeutic target in clinic.
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R777.31

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2221886