發(fā)布時間：2018-08-06 08:52

【摘要】：耳蝸螺旋神經節(jié)（Spiral ganglion, SG）主要是由神經元和膠質細胞共同構成的外周感覺神經節(jié)組織，位于耳蝸蝸螺旋小管內，沿耳蝸軸螺旋式分布。螺旋神經元（Spiral ganglion neurons, SGNs）是位于螺旋神經節(jié)內的初級聽覺傳入神經元，將螺旋器感覺毛細胞感知的聲信息向聽覺中樞傳遞。根據形態(tài)學特征、周圍神經支配形式和生理功能特點，可將SGNs分為兩種類型：I型SGNs為胞體較大、有髓鞘的雙極神經元，約占SGNs總數的90~95%，支配內毛細胞并對不同頻率的聲信號進行編碼；II型SGNs為胞體較小、無髓鞘的假單極神經元，所占比例較少，支配外毛細胞和部分支持細胞，通過控制感覺上皮對聲音的敏感性而反饋調節(jié)聽覺感受。噪聲、耳毒性藥物、老齡化、基因突變等原發(fā)性因素，以及毛細胞死亡引發(fā)的繼發(fā)性損傷都可造成SGNs變性、死亡，最終導致永久性聽力損失（感音神經性聾）。探明在初級聽覺神經元神經生理和突觸傳遞過程中發(fā)揮重要調節(jié)作用的神經遞質、調質以及神經活性物質的表達、功能、相互作用，及其在生理、病理條件下參與調節(jié)聽覺信號轉導的具體機制，有望為聽力損傷的有效預防和治療提供重要依據。 雪旺細胞（Schwann cells, SCs）和衛(wèi)星細胞（Satellite glial cells, SGCs）是螺旋神經節(jié)內主要的膠質細胞。SCs與SGNs的神經纖維（神經突）緊密聯(lián)系，并與I型SGNs的神經纖維形成髓鞘結構；SGCs緊密包繞SGNs胞體，共同構成一個功能性單元，并與I型SGNs胞體形成髓鞘結構。盡管對螺旋神經節(jié)內SGCs的具體功能仍然不清楚，但研究發(fā)現外周感覺神經節(jié)內的SGCs表達多種離子通道、神經遞質受體以及神經營養(yǎng)因子來調節(jié)神經突觸傳遞過程中的神經活性，并且形成一個與血腦屏障十分類似的選擇性通透屏障來調節(jié)局部神經微環(huán)境和代謝，這些特點與中樞神經系統(tǒng)（CNS）的星形膠質細胞具有諸多相似之處。感覺神經節(jié)內神經元-SGCs間相互聯(lián)系或相互作用（Neuron SGCs communication），是調節(jié)神經突觸傳遞、神經代謝平衡和神經保護作用的重要基礎。因此，探尋調節(jié)螺旋神經節(jié)內SGN-SGC間相互聯(lián)系的新靶點和新藥物，有望為聽力損傷的防治提供新的策略。 心鈉素（Atrial natriuretic peptide,ANP）是由心房肌細胞合成、分泌的28個氨基酸多肽類激素，具有強大的排鈉、利尿和血管舒張活性，是利鈉肽家族中的一員，后者還包括B型利鈉肽和C型利鈉肽。ANP與兩種定位于靶細胞膜上的高親和功能受體相互作用，進而發(fā)揮維持血壓、細胞外液體容積和心血管體液動態(tài)平衡等重要生物學效應。利鈉肽A型受體（Natriuretic peptide receptor-A, NPR-A）具有鳥苷酸環(huán)化酶（guanylyl cyclase, GC）催化活性，可催化細胞內第二信使環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）的形成，繼而調節(jié)三種cGMP結合蛋白：①依賴于cGMP的蛋白激酶（PKG）、②依賴于cGMP的磷酸二酯酶（cGMP-regulated PDEs）、③環(huán)核苷酸門控離子通道（CNG），發(fā)揮多種生物學效應，包括調節(jié)血管緊張度、神經元興奮性、跨上皮離子轉運，以及視覺、嗅覺信號轉導。利鈉肽C型受體（Natriuretic peptide receptor-C, NPR-C）也稱為清除受體，缺乏鳥苷酸環(huán)化酶催化結構域，通過受體介導的內化和降解作用調節(jié)局部利鈉肽濃度。研究表明NPR-C可通過百日咳毒素敏感的抑制性鳥嘌呤核苷酸調節(jié)蛋白（Gi），或磷脂酶C途徑，抑制環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的合成，進而影響多種組織第二信使系統(tǒng)的信號轉導，對cGMP的水平不造成影響。 除了心血管系統(tǒng)，ANP及其功能受體（NPR-A, NPR-C）在其他組織如腎臟、腎上腺、肺、脂肪組織、視網膜等也具有分布。此外，它們在CNS也具有表達，提示ANP可能作為一種重要的神經調質或神經肽參與神經和膠質功能的調節(jié)。關于ANP及其受體在鼠類內耳感覺以及分泌區(qū)域的分布也有報道，提示ANP可能作為一種局部激素參與內耳水電解質平衡的調節(jié)。既往研究證實ANP受體在豚鼠蝸軸組織以及大鼠螺旋神經節(jié)等耳蝸神經感覺區(qū)域具有表達，但ANP及其受體在螺旋神經節(jié)內的具體定位和功能仍然不清楚。基于以上思考，本研究中通過免疫組織化學（immunohistochemistry）、逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）以及蛋白印跡（Westernblot）方法，檢測ANP及其功能受體（NPR-A, NPR-C）在大鼠螺旋神經節(jié)內的細胞定位和在出生后不同發(fā)育時期大鼠螺旋神經節(jié)內的表達變化，并探討ANP及其受體對于螺旋神經節(jié)功能可能具有的調節(jié)作用。本研究證實了ANP及其受體在出生后不同發(fā)育時期大鼠耳蝸螺旋神經節(jié)中具有表達，其主要定位于螺旋神經節(jié)的神經元和衛(wèi)星細胞中；出生后各發(fā)育時期的大鼠耳蝸螺旋神經節(jié)具有合成、表達ANP及其受體的能力，ANP及其受體mRNA和蛋白表達量隨著出生后發(fā)育發(fā)生變化。我們認為ANP可能作為內耳的一種重要的神經調質或神經肽，參與耳蝸螺旋神經節(jié)神經、膠質功能以及神經元-衛(wèi)星細胞間相互聯(lián)系的調節(jié)，進而影響內耳聲信號轉導和聽覺系統(tǒng)發(fā)育。 第一部分：ANP及其受體在大鼠耳蝸螺旋神經節(jié)的表達 目的：明確ANP及其受體在大鼠耳蝸螺旋神經節(jié)的細胞定位、合成表達情況。 方法：取出生后（第7日，P7）大鼠耳蝸行冰凍切片和超薄切片，通過對耳蝸組織切片行免疫組織化學染色，激光共聚焦顯微鏡和透射電子顯微鏡檢測ANP及其受體在螺旋神經節(jié)的細胞定位；取大鼠蝸軸組織，通過RT-PCR和Western blot方法，檢測組織內ANP及其受體mRNA和蛋白的合成、表達情況。 結果：免疫組織化學方法（免疫熒光和免疫電鏡）證實ANP及其受體在大鼠耳蝸螺旋神經節(jié)的兩型SGNs以及SGCs具有共表達，其在SGNs的共表達具有不均一性（在部分SGNs的共表達相對較弱）。ANP主要定位在I、II型SGNs核周體胞質中，以及SGCs胞質中；NPR-A和NPR-C主要定位于I、II型SGNs以及SGCs質膜上和近質膜胞質中。以ANP、NPR-A和NPR-C的特異性上、下游引物，通過RT-PCR方法在大鼠蝸軸組織中擴增出其目的基因條帶，證實大鼠蝸軸組織表達ANP及其受體的mRNA；以ANP、NPR-A和NPR-C的特異性抗體，通過Western blot方法在大鼠蝸軸組織中檢測出其目的蛋白條帶，證實大鼠蝸軸組織表達ANP及其受體的蛋白。 結論：ANP及其受體主要定位于大鼠耳蝸螺旋神經節(jié)的神經元和衛(wèi)星細胞中，其mRNA和蛋白在蝸軸組織也具有表達。本研究證實了大鼠耳蝸螺旋神經節(jié)具有合成、表達ANP及其受體的能力，提示ANP可能通過與其受體作用，參與耳蝸螺旋神經節(jié)內神經與膠質功能，以及SGN-SGC間相互聯(lián)系的調節(jié)。 第二部分：ANP及其受體在出生后不同發(fā)育時期大鼠耳蝸螺旋神經節(jié)的表達 目的：明確ANP及其受體在出生后不同發(fā)育時期大鼠耳蝸螺旋神經節(jié)的表達特征。 方法：取出生后不同發(fā)育時期（P0、P7、P14、P21和P28）大鼠耳蝸行冰凍切片，通過對耳蝸組織切片行免疫組織化學染色，激光共聚焦顯微鏡檢測ANP及其受體在各發(fā)育時期大鼠螺旋神經節(jié)的表達情況；取各發(fā)育時期大鼠蝸軸組織，通過RT-PCR和Western blot方法檢測組織內ANP及其受體mRNA和蛋白的合成、表達變化。 結果：免疫組織化學方法證實ANP及其受體在出生后各發(fā)育時期的大鼠螺旋神經節(jié)中均有表達；RT-PCR和Western blot方法在各發(fā)育時期大鼠蝸軸組織檢測到ANP、NPR-A和NPR-C的mRNA和蛋白，證實其具有合成ANP及其受體的能力。ANP mRNA在大鼠蝸軸組織中的表達量于出生時（P0）為最低，隨著發(fā)育迅速升高，在成年時期（P28）達最高水平。NPR-A mRNA在大鼠蝸軸組織中的表達量于出生時（P0）為最高，隨著發(fā)育迅速降低，，在成年時期（P28）達最低水平。NPR-C mRNA在大鼠蝸軸組織中的表達量于出生后（P0）為最高，隨著發(fā)育逐漸降低且變化相對較小，在成年時期（P28）有輕微升高。ANP蛋白在大鼠蝸軸組織中的表達量于出生后（P0）開始升高，于出生后第7日（P7）為最高水平，隨著發(fā)育迅速降低，在成年時期（P28）達最低水平。NPR-A蛋白在大鼠蝸軸組織中的表達量于出生時（P0）為最高，隨著發(fā)育逐漸降低，在成年時期（P28）水平相對較低。NPR-C蛋白在大鼠蝸軸組織中的表達量于出生后（P0）為最高，隨著發(fā)育逐漸降低，至出生后第14日（P14）聽力形成時水平最低，隨后在成年時期（P28）有輕微升高。 結論：ANP及其受體在出生后各發(fā)育時期大鼠耳蝸螺旋神經節(jié)中均具有表達，并且其mRNA和蛋白在大鼠蝸軸組織的表達量隨出生后發(fā)育而發(fā)生改變。ANP及其受體蛋白在蝸軸組織中的表達量均隨著出生后聽覺發(fā)育成熟而相應下調，提示ANP可能通過與其受體作用，參與出生后螺旋神經節(jié)的神經和膠質發(fā)育，以及SGN-SGC間相互聯(lián)系建立過程的調節(jié)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R764

【參考文獻】

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本文編號：2167191