發(fā)布時間：2018-07-28 14:36

【摘要】：背景： 視網膜變性疾病是一類以進行性視功能下降為臨床特征的疾病,具有遺傳性或后天獲得性,是臨床上多見而又難治的一類致盲性眼病。視網膜色素變性作為最常見的遺傳性視網膜變性疾病,其遺傳方式多樣,致病基因多種,深入的致病機制仍然不明確,目前尚無有效的治療方法。對于視網膜變性疾病,由于其取材的受限性,難以建立體外細胞研究模型。2007年日本科學家Yamanaka等人發(fā)明了人類體細胞誘導的多潛能干細胞(human induced pluripotent stem cell, hiPSC)技術。通過這一技術,理論上可產生大量的與胚胎干細胞同等分化潛能的多潛能干細胞。利用患者自身的體細胞誘導產生的hiPS細胞及其分化產生的視網膜細胞,可為視網膜變性疾病建立體外的細胞研究模型。hiPS細胞以及其分化產生的各類視網膜細胞還可在各類視網膜變性疾病中探索干細胞替代治療,為攻克此類難治的致盲性眼病帶來希望。 目的： 本課題研究目的在于：(1)將視網膜色素變性患者的皮膚成纖維細胞,通過導入外源基因,誘導其成為多潛能干細胞(hiPSC);(2)在此過程中探索視網膜變性患者體細胞重編程的機制過程,并為進一步向視網膜細胞的定向分化及機制研究奠定基礎。 材料和方法： 本研究取IFT140基因突變的視網膜色素變性的1名患者及1名正常對照受試者的皮膚組織樣本進行原代培養(yǎng),建立人皮膚成纖維細胞系(human dermal fibroblast, HDF)。并取CF-1品系小鼠13.5天胚胎,分離并培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF),培養(yǎng)至P3代后,經絲裂霉素C處理后制成飼養(yǎng)層細胞(feeder cell)。 實驗中利用含Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc四種重組基因的慢病毒質粒以及慢病毒包裝質粒PVSVG和△8.91,在人胚腎細胞(293HEK-T)中包裝出四種分別含有Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc重組基因的慢病毒顆粒。 在P1代人皮膚成纖維細胞中按1：10的比例加入過量的慢病毒顆粒和助轉劑polybrene,誘導人成纖維細胞轉變成誘導多潛能干細胞。誘導第5天后消化細胞,轉至MEF制作成的飼養(yǎng)層細胞上繼續(xù)培養(yǎng),直至出現圓形類胚胎干細胞形態(tài)的誘導多潛能干細胞克隆。挑出克隆進行擴大培養(yǎng)和維持。對感染前和感染后的人皮膚成纖維細胞進行相關基因的熒光實時定量PCR的檢測,鑒定干細胞相關基因和成纖維細胞特異基因的表達變化。 結果： (1)成功建立視網膜色素變性患者及正常受試者的人皮膚成纖維細胞系,形態(tài)為長梭形,呈編織狀、漩渦狀密集排列生長,大量表達FSP-1基因。凍存后復蘇率達50-75%不等。 (2)成功利用CF-1品系小鼠的MEF細胞,制作成飼養(yǎng)層細胞。凍存后復蘇率達75%。 (3)利用含Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc四種重組基因的慢病毒質粒以及慢病毒包裝質粒PVSVG和△8.91,在人胚腎細胞(293HEK-T)中包裝出四種分別含有Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc重組基因的慢病毒顆粒。滴度分別為1.4×107TU/ml;1.2×107TU/ml;2.0×107TU/ml和3.5×106TU/ml。 (4)慢病毒感染人皮膚成纖維細胞后,顯微鏡下觀察到細胞逐漸變圓,細胞核增大,在18-20天左右感染后細胞聚集成圓形、類似胚胎干細胞的克隆。 (5)對比感染前、后的人皮膚成纖維細胞的相關基因表達水平,感染后,FSP-1mRNA水平顯著下調,endo-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc和Nanog基因的mRNA水平顯著上調(p0.05)。 結論： 本研究首次利用IFT140基因突變的視網膜色素變性患者的皮膚成纖維細胞,用慢病毒誘導的方式,導入外源基因Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc,成功誘導體細胞出現類似人胚胎干細胞的形態(tài)變化,并表達干細胞特異的內源性基因。
[Abstract]:Background:
Retinal degeneration is a kind of disease characterized by progressive visual function decline, hereditary or acquired acquired. It is a kind of blind eye disease which is frequently seen and difficult to treat in clinical. Retinitis pigmentosa is the most common hereditary retinal degeneration disease. It has many ways of inheritance, many kinds of pathogenic genes and deep pathogenicity. The mechanism is still not clear and there is no effective treatment. For the retinal degeneration disease, because of its limitations, it is difficult to establish an in vitro cell research model.2007 Japanese scientist Yamanaka and others invented the human somatic cell induced pluripotent stem cells (human induced pluripotent stem cell, hiPSC). Technology, in theory, produces a large number of pluripotent stem cells that have the same differentiation potential as embryonic stem cells. The hiPS cells and their differentiated retinal cells, induced by the somatic cells of the patient's own, can be used to establish the cell research model.HiPS cells in vitro for the retina denatured disease and the various types of retina produced by its differentiation. Cells can also explore stem cell replacement therapy in various types of retinal degenerative diseases, hoping to overcome such refractory blinding eye diseases.
Objective:
The purpose of this research is as follows: (1) the skin fibroblasts of patients with retinitis pigmentosa can be introduced into the multipotential stem cells (hiPSC) by introducing foreign genes, and (2) to explore the mechanism of reprogramming of the somatic cells of the retinal degeneration patients in this process, and to lay a foundation for further directional differentiation and mechanism research of retinal cells. Set the foundation.
Materials and methods:
In this study, 1 patients with retinitis pigmentosa with IFT140 gene mutation and 1 normal control subjects were cultured for primary culture, and the human skin fibroblast line (human dermal fibroblast, HDF) was established, and 13.5 day embryos of CF-1 strain mice were taken to isolate and cultivate mouse embryonic fibroblasts (mouse embryonic fibro). Blast (MEF), cultured to P3 generation, was treated with mitomycin C to form feeder layer cells (feeder cell).
In the experiment, four lentivirus plasmids containing Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc and lentivirus package plasmids PVSVG and delta 8.91 were used in the experiment to pack four kinds of lentivirus particles containing Oct4, Klf4, Sox2 and c-Myc recombinant genes in human embryonic kidney cells (293HEK-T).
In the P1 generation of human skin fibroblasts, an excessive amount of lentivirus particles and auxiliary agent Polybrene were added at 1:10 proportion to induce human fibroblasts to induce pluripotent stem cells. Fifth days later, the digestive cells were induced to continue to be cultured on the feeder cells made from MEF until the appearance of the morphology of the round embryonic stem cells appeared. Potential stem cell clones. Pick out clones for expansion and maintenance. Detection of fluorescence real-time quantitative PCR for the related genes of human skin fibroblasts before and after infection, and identify the changes in the expression of stem cell related genes and fibroblast specific genes.
Result:
(1) the human skin fibroblast line of the patients with retinitis pigmentosa and normal subjects was successfully established. The morphology of the human skin fibroblast cell line was long spindle shaped, woven and swirling in dense arrangement of the FSP-1 gene. The resuscitation rate was not equal to 50-75% after the cryopreservation.
(2) successful use of MEF cells from CF-1 strain mice was made into feeder cells. After cryopreservation, the recovery rate reached 75%.
(3) using four lentivirus plasmids containing Oct4, Klf4, Sox2 and c-Myc, and lentivirus package plasmids PVSVG and delta 8.91, four lentivirus particles containing Oct4, Klf4, Sox2 and c-Myc recombinant genes were packed in human embryonic kidney cells (293HEK-T). The titers were 1.4 * 107TU/ml, 1.2 * 107TU/ml, 2 * and 3.5.
(4) after infection of the human skin fibroblasts of the lentivirus, the cells gradually became round and the nuclei were enlarged under the microscope. After 18-20 days of infection, the cells were aggregated and round, similar to the cloning of embryonic stem cells.
(5) the level of related gene expression in human skin fibroblasts was compared before and after infection. After infection, the level of FSP-1mRNA was significantly down, and the mRNA level of endo-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc and Nanog genes was significantly up (P0.05).
Conclusion:
In this study, we first used IFT140 gene mutation in the skin fibroblasts of the patients with retinitis pigmentosa. The exogenous gene Oct4, Klf4, Sox2 and c-Myc were introduced in the way of lentivirus induction. The morphological changes of somatic cells similar to human embryonic stem cells were induced, and the specific endogenous genes were expressed in the stem cells.
【學位授予單位】：北京協和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R774.13

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 魏新偉;張曉剛;;誘導性多潛能干細胞的研究進展及臨床應用前景[J];心血管病學進展;2010年06期

2 薩日娜;李喜和;李榮鳳;;誘導性多潛能干細胞的研究進展[J];中國細胞生物學學報;2010年05期

3 郝巖;馮世慶;;誘導多潛能干細胞研究應用新進展[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2011年18期

4 劉麗;;胚胎多潛能干細胞及硫酸鋅治療糖尿病足[J];中國社區(qū)醫(yī)師(醫(yī)學專業(yè));2011年32期

5 梁騎;唐中;;誘導性多潛能干細胞的研究現狀和應用前景[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2011年20期

6 ;實驗室[J];科技創(chuàng)業(yè);2011年Z1期

7 潘聰;楊柳;孫建平;;誘導多潛能干細胞在臨床治療中的研究進展及前景分析[J];中國醫(yī)藥指南;2012年22期

8 李海存;單連慧;鐘華;黃家學;安新穎;;從信息學的角度分析誘導性多潛能干細胞的研究現狀[J];中華細胞與干細胞雜志(電子版);2012年04期

9 石嶸;周玨宇;鄭文嶺;馬文麗;;誘導性多潛能干細胞技術及應用研究進展[J];基礎醫(yī)學與臨床;2013年01期

10 張楊;李秀蘭;;誘導性多潛能干細胞的安全性及臨床應用[J];中國組織工程研究;2013年27期

相關會議論文 前6條

1 芮榮;;豬轉基因多潛能干細胞系的建立[A];加入WTO和中國科技與可持續(xù)發(fā)展——挑戰(zhàn)與機遇、責任和對策（下冊）[C];2002年

2 趙春華;;多潛能干細胞生物學及表觀遺傳學調控機制研究[A];第13屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2011年

3 陳瑤;鄭育亮;邱東波;張志光;;人牙髓細胞來源的誘導多潛能干細胞系的建立[A];第九次全國顳下頜關節(jié)病學及(牙合)學研討會論文匯編[C];2012年

4 盧飚;孫元明;李雨民;朱梅;楊福軍;邱明才;;OVX小鼠和正常小鼠脾多潛能干細胞誘導破骨細胞樣細胞基因表達差異顯示研究[A];中華醫(yī)學會第三次全國骨質疏松和骨礦鹽疾病學術會議暨骨質疏松診斷技術繼續(xù)教育學習班論文匯編[C];2004年

5 盧飚;朱梅;邱明才;孫元明;李雨民;楊福軍;;OVX小鼠和正常小鼠脾多潛能干細胞誘導破骨細胞樣細胞基因表達差異顯示研究[A];中華醫(yī)學會第四次全國骨質疏松和骨礦鹽疾病學術會議論文匯編[C];2006年

6 葉金海;徐袁瑾;顏世果;趙君;涂旗勝;張瑾;段學靜;Sommer CA;Mostoslavsky G;Kaplan DL;陳錦坤;;SATB2基因轉導誘導多潛能干細胞(iPSCs)修復小鼠極量顱骨骨缺損[A];2011中國（威海）干細胞與組織工程治療前沿論壇論文集[C];2011年

相關重要報紙文章 前3條

1 邱仁宗;誘導多潛能干細胞如何規(guī)避倫理風險[N];健康報;2013年

2 ;使用小分子化合物逆轉“發(fā)育時鐘”[N];中國醫(yī)藥報;2013年

3 ;未知世界中的那些中國發(fā)現[N];科技日報;2014年

相關博士學位論文 前9條

1 肖慶;小鼠視網膜多潛能干細胞的分離培養(yǎng)和小鼠胚胎干細胞向視網膜色素上皮細胞定向分化的研究[D];中南大學;2010年

2 吳月紅;誘導新生狨猴皮膚成纖維細胞來源的多潛能干細胞的研究[D];西北農林科技大學;2010年

3 王鳳武;綿羊羊水來源多潛能干細胞生物學特性研究[D];內蒙古農業(yè)大學;2014年

4 艾民;人誘導性多潛能干細胞的建立和鑒定[D];南方醫(yī)科大學;2012年

5 宋檀婧;BMP信號通路在多潛能干細胞向前脂肪細胞定向中作用及機制研究[D];復旦大學;2008年

6 朱梅;源于脾多潛能干細胞的破骨細胞樣細胞體外培養(yǎng)及其對成骨細胞生長和功能的影響[D];天津醫(yī)科大學;2003年

7 范安然;Tetl基因在豬誘導多潛能干細胞特性維持中的作用研究[D];吉林大學;2013年

8 王繹忱;視網膜色素變性患者自體誘導多潛能干細胞系的建立與應用[D];北京協和醫(yī)學院;2014年

9 王杉杉;Gdf6和Egr2在多潛能干細胞向前脂肪細胞定向過程中的作用及機制研究[D];復旦大學;2013年

相關碩士學位論文 前10條

1 歐陽申;重構多潛能干細胞技術[D];復旦大學;2011年

2 何歲勤;小鼠誘導多潛能干細胞的體外培養(yǎng)和兔角膜內皮細胞的體外分離培養(yǎng)及共培養(yǎng)研究[D];大連醫(yī)科大學;2013年

3 肖冰;人胚胎來源多潛能干細胞向脂肪和神經細胞分化的研究[D];吉林大學;2010年

4 李巖;人胚胎來源多潛能干細胞向成骨細胞分化的研究[D];吉林大學;2010年

5 李磊;人胚胎多潛能干細胞向胰島素分泌細胞轉化的研究[D];吉林大學;2009年

6 張e，

本文編號：2150549