本文選題：晶狀體分化 + 白內(nèi)障��； 參考：《華中科技大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：熱休克因子是生物體內(nèi)的一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)控?zé)嵝菘说鞍讘?yīng)對(duì)內(nèi)外環(huán)境的各種脅迫，并參與機(jī)體的多種生理功能。熱休克因子4（Heat Shock Factor4，HSF4）在晶狀體細(xì)胞中高度表達(dá)，在晶狀體的形成和分化過(guò)程中起重要的作用。HSF4突變可導(dǎo)致先天性和老年性白內(nèi)障的發(fā)生，但是HSF4導(dǎo)致白內(nèi)障的分子機(jī)理并不完全清楚。本論文從HSF4基因與DNA損傷修復(fù)、HSF4調(diào)控DNA酶DLAD，以及HSF4和p53的相互作用關(guān)系等三個(gè)全新的方面，研究HSF4的功能及其突變引起白內(nèi)障的病理機(jī)制。 晶狀體中DNA損傷的不斷累積是老年性白內(nèi)障生成的一個(gè)重要原因，及時(shí)地清除DNA損傷對(duì)維持晶狀體的正常功能十分必要。在本研究中，我們首先發(fā)現(xiàn)HSF4能夠促進(jìn)修復(fù)紫外線導(dǎo)致的DNA損傷和DNA鏈的斷裂，而HSF4的白內(nèi)障致病突變不具有修復(fù)這些DNA損傷的能力。Rad51是DNA同源重組修復(fù)通路中的關(guān)鍵催化酶。我們的研究發(fā)現(xiàn)HSF4通過(guò)調(diào)控Rad51起到DNA損傷修復(fù)功能：利用Rad51啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告載體和染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)HSF4能直接結(jié)合在Rad51啟動(dòng)子上的熱休克元件上啟動(dòng)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而HSF4的白內(nèi)障致病突變卻失去此功能；通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡技術(shù)，進(jìn)一步證實(shí)HSF4的DNA損傷修復(fù)功能是依賴于Rad51；過(guò)表達(dá)Rad51可以回補(bǔ)由HSF4突變導(dǎo)致的DNA損傷修復(fù)障礙；喜樹(shù)堿處理能夠通過(guò)抑制Rad51表達(dá)水平的上調(diào)進(jìn)而抑制HSF4的DNA損傷修復(fù)功能；在斑馬魚中利用morpholino技術(shù)敲除HSF4，導(dǎo)致斑馬魚中Rad51的表達(dá)減少，及晶狀體中DNA損傷增加。我們的研究首次明確表明先天性白內(nèi)障的致病基因能夠直接參與DNA損傷修復(fù)，為了解先天性和老年性白內(nèi)障形成的病理機(jī)制提供了一個(gè)全新的視角。 晶狀體纖維細(xì)胞的去核過(guò)程是完成晶狀體分化的必要步驟。DNase2β（DLAD）是脊椎動(dòng)物晶狀體中存在的主要DNase，在晶狀體分化過(guò)程中發(fā)揮重要功能，敲除DLAD的小鼠會(huì)出現(xiàn)核性白內(nèi)障表型。通過(guò)DLAD啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告載體和染色質(zhì)沉淀實(shí)驗(yàn)，我們的研究發(fā)現(xiàn)HSF4通過(guò)直接結(jié)合在DLAD的啟動(dòng)子上上調(diào)DLAD的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)其DNase活性。HSF4的白內(nèi)障致病突變破壞其與DLAD啟動(dòng)子的結(jié)合能力，喪失其上調(diào)DLAD表達(dá)的能力從而影響DNase活性。在體內(nèi)，我們應(yīng)用morpholino抑制斑馬魚HSF4表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HSF4下調(diào)的斑馬魚，晶狀體在分化過(guò)程中細(xì)胞核的去除不完全。與之相一致的是斑馬魚DLAD的蛋白水平和DNase活性下降。說(shuō)明HSF4通過(guò)上調(diào)DLAD的表達(dá)，參與晶狀體分化的去核化過(guò)程。我們的研究結(jié)果找到了一條解釋HSF4突變導(dǎo)致白內(nèi)障生成的全新分子途徑，幫助我們更深入地了解HSF4在晶狀體分化中的功能。 應(yīng)用免疫共沉淀和pull down技術(shù)，我們首次發(fā)現(xiàn)HSF4和p53存在相互作用。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為我們研究HSF4和p53在晶狀體分化和發(fā)育中的功能，揭示相關(guān)的調(diào)控通路，為我們進(jìn)一步研究HSF4和p53在白內(nèi)障生成中的分子機(jī)制提供了全新的思路。 通過(guò)對(duì)以上內(nèi)容的研究，我們首先闡述了HSF4參與白內(nèi)障生成的一條全新分子通路，即通過(guò)調(diào)控Rad51的表達(dá)參與DNA損傷修復(fù)。其次，我們明確了HSF4通過(guò)上調(diào)DLAD的表達(dá)促進(jìn)晶狀體發(fā)育過(guò)程中纖維細(xì)胞的去核化過(guò)程。最后，通過(guò)鑒定HSF4與p53的相互作用，，我們?yōu)檠芯縃SF4和p53的生理功能提供了新的方向。
[Abstract]:Heat shock factor 4 ( Heat Shock Factor 4 , HSF4 ) plays an important role in the formation and differentiation of lens cells .

In this study , we find that HSF4 can promote the repair of DNA damage and DNA strand breakage induced by ultraviolet light . In this study , we find that HSF4 can promote the repair of DNA damage caused by ultraviolet light . Rad51 is the key catalytic enzyme in DNA homologous recombination repair pathway .
The DNA damage repair function of HSF4 was confirmed by real - time quantitative PCR and Western blotting technique , which depended on Rad51 ;
overexpression of Rad51 can be used to repair DNA damage repair disorder caused by HSF4 mutation ;
camptothecin treatment can inhibit the DNA damage repair function of HSF4 by inhibiting the up - regulation of the expression level of Rad51 ;
It is the first time that the pathogenesis of congenital cataract can be directly involved in the repair of DNA damage , which provides a new visual angle for understanding the pathological mechanism of congenital and senile cataract .

In vivo , we find that HSF4 plays an important role in the process of lens differentiation . In vivo , we find that HSF4 can increase the transcription and expression of DLAD by directly binding to the promoter of DLAD . In vivo , we find that HSF4 can inhibit the expression of DLAD . It has been found that HSF4 can regulate the expression of DLAD and participate in the nucleation process of lens differentiation . It is found that HSF4 is a new molecular pathway for cataract formation by regulating the expression of DLAD . It helps us to understand the function of HSF4 in lens differentiation .

We have found that HSF4 and p53 function in lens differentiation and development , and reveal the relevant regulatory pathways , which provide a brand - new idea for further studying the molecular mechanism of HSF4 and p53 in cataract formation .

Through the study of the above contents , we first introduced a new molecular pathway involved in the formation of cataract by HSF4 , that is , by regulating the expression of Rad51 in the repair of DNA damage . Secondly , we identified HSF4 by up - regulating the expression of DLAD to promote the demethylation of fibroblasts . Finally , by identifying the interaction between HSF4 and p53 , we provide a new direction for studying the physiological function of HSF4 and p53 .
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R776.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2089330