本文選題：水通道蛋白-1 + 晶狀體上皮細胞��； 參考：《福建醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：目的:研究水通道蛋白1(Aquaporin1 AQP1)對晶體上皮細胞(Lens Epithelial Cells,LECs)活力和晶體蛋白含量的影響,探討AQP1在白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展中的作用及可能機制。方法:實驗分三個部分進行:(1)將設計好的針對AQP1基因的si RNA通過慢病毒感染人晶體上皮細胞,對其AQP1基因進行RNA干擾,抑制AQP1基因在LECs上的表達;并通過實時熒光定量PCR和Western Blot檢測AQP1基因表達下調(diào)情況。(2)AQP1基因表達下調(diào)后,分別通過透射電鏡、CCK-8試劑盒和流式細胞儀觀察人晶體上皮細胞形態(tài)改變、細胞增殖能力和凋亡情況。(3)AQP1基因表達下調(diào)后,利用激光共聚焦顯微鏡和熒光鈣離子探針檢測晶體細胞內(nèi)游離鈣離子濃度;并通Western Blot檢測鈣蛋白酶2和α、β、γ三種晶體蛋白的表達變化情況。結(jié)果:1、經(jīng)過慢病毒感染針對AQP1基因進行RNA干擾的干擾組1和干擾組2細胞與正常細胞對照組相比,其AQP1基因的m RNA水平有顯著下調(diào)(P0.05);同時其AQP1基因的蛋白表達有明顯下調(diào)(P0.05)。而針對基因庫中所有人源基因均無同源性的非特異干擾組與正常對照組相比其AQP1基因的m RNA水平和蛋白表達無差別(P0.05)。2、與正常對照組相比,在透射電鏡下觀察干擾組1和干擾組2凋亡細胞較為多見,凋亡細胞表面微絨毛減少,胞質(zhì)濃縮、胞體變小,細胞核體積縮小,核內(nèi)染色質(zhì)凝聚,但核膜完整,并出現(xiàn)凋亡小體。CCK-8試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)干擾組1、干擾組2與正常對照組,非特異干擾組相比,其在450nm波長處的OD值明顯低于正常組(P0.05)。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)干擾組1、干擾組2的細胞凋亡率明顯高于正常對照組和非特異干擾組(P0.05)。3、通過激光掃描共聚焦顯微和熒光鈣離子探針檢測發(fā)現(xiàn)干擾組1、干擾組2與正常對照組、非特異干擾組相比,其細胞內(nèi)游離鈣離子熒光強度明顯增強(P0.05)。同時通過Western Blot法發(fā)現(xiàn)干擾組1、干擾組2細胞內(nèi)的鈣蛋白酶2表達含量增加,而α、β、γ三種晶體蛋白的表達含量減少,與對照組相比有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:1、應用攜帶設計好的si RNA序列質(zhì)粒的慢病毒感染人晶體上皮,對其AQP1基因進行RNA干擾,可明顯下調(diào)AQP1基因的m RNA和蛋白的表達量,達到沉默人晶狀體上皮細胞AQP1基因的目的。2、AQP1是晶狀體上皮細胞主要的膜蛋白,在維持晶體上皮細胞的正常生理功能中起重要作用,AQP1的減少將導致細胞內(nèi)鈣離子濃度增高,打破細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,從而觸發(fā)細胞凋亡。而晶體上皮細胞是人透明晶狀體營養(yǎng)代謝不可或缺的關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此AQP1的下調(diào),可通過晶體上皮細胞,在白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展過程中產(chǎn)生作用。3、AQP1的減少,可導致細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高,繼而激發(fā)鈣蛋白酶2表達含量增高,最終不同程度降解α、β、γ三種晶體蛋白;而α、β、γ晶體蛋白是維護人晶狀體透明性的重要蛋白質(zhì),并且在白內(nèi)障的形成中都會有所改變,因此AQP1的減少與白內(nèi)障形成之間存在著某種聯(lián)系。
[Abstract]:Aim: to study the effect of aquaporin 1(Aquaporin1 AQP1 on the activity and the content of crystal protein in lens epithelial cells (Lens Epithelial cells), and to explore the role and possible mechanism of AQP1 in the development of cataract. Methods: the designed si RNA for AQP1 gene was infected with human lens epithelial cells by lentivirus. The AQP1 gene was interfered by RNA to inhibit the expression of AQP1 gene on LECs. After the down-regulation of AQP1 gene expression was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western Blot, the morphological changes of human lens epithelial cells were observed by transmission electron microscope (TEM) CCK-8 kit and flow cytometry, respectively. After the expression of AQP1 gene was down-regulated, the intracellular free calcium concentration was detected by laser confocal microscopy and fluorescence calcium probe. The expression of calpain 2 and 偽, 尾, 緯 was detected by Western Blot. Results compared with normal cells, the m RNA level of AQP1 gene and the protein expression of AQP1 gene were significantly down-regulated in RNA interference group 1 and control group 2, which were infected with lentivirus and infected with lentivirus, respectively. However, there was no difference in m RNA level and protein expression of AQP1 gene between nonspecific interference group and normal control group, and there was no significant difference in m RNA level and protein expression between non-specific interference group and normal control group. Under transmission electron microscope, apoptotic cells were observed more frequently in interference group 1 and interference group 2. The surface microvilli of apoptotic cells were decreased, cytoplasm was concentrated, cell body became smaller, nuclear volume was reduced, chromatin condensed in nucleus, but nuclear membrane was intact. The detection of apoptotic corpuscles. CCK-8 kit showed that the OD value of interference group 2 was significantly lower than that of normal group at the wavelength of 450nm compared with normal control group and non-specific interference group (P 0.05). The apoptosis rate of interference group 2 was significantly higher than that of normal control group and non-specific interference group (P0.05. 3). The results of laser scanning confocal microscopy and fluorescence calcium probe test showed that interference group 1 and interference group 1. (2) compared with the normal control group, Compared with the nonspecific interference group, the fluorescence intensity of intracellular free calcium ion increased significantly (P 0.05). At the same time, it was found by Western Blot method that the expression of calpain 2 in interference group 1 was increased, while the expression of 偽, 尾 and 緯 crystal proteins was decreased, which was significantly higher than that in control group (P 0.05). Conclusion: the expression of m RNA and protein in AQP1 gene can be significantly down-regulated by RNA interference of AQP1 gene in human lens epithelium infected with lentivirus carrying the designed si RNA sequence plasmid. The aim of silencing the AQP1 gene of human lens epithelial cells. 2AAQP1 is the main membrane protein of lens epithelial cells. The decrease of AQP1 plays an important role in maintaining the normal physiological function of lens epithelial cells. The decrease of AQP1 will lead to the increase of intracellular calcium concentration. Break the stability of the cell environment, thus triggering cell apoptosis. The lens epithelium is an indispensable key link in the nutritional metabolism of human transparent lens. Therefore, the down-regulation of AQP1 may play a role in the reduction of AQP1 during the development of cataract through lens epithelial cells. It can lead to the increase of intracellular calcium ion concentration, and then stimulate the increase of the expression of calpain 2, and eventually degrade 偽, 尾, 緯 to varying degrees, and 偽, 尾, 緯 crystal protein is an important protein to maintain the transparency of human lens. And the formation of cataract will change, so there is a relationship between the decrease of AQP1 and cataract formation.
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R776.1

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本文編號：1936314