發(fā)布時間：2018-05-17 15:48

  本文選題：慢病毒 + 角膜基質��； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2011年碩士論文

【摘要】：目的:觀察以慢病毒作為載體,介導增強型綠色熒光蛋白(lenti-EGFP)這一報告基因,通過兩種方式體內轉染大鼠角膜基質細胞的有效性和安全性,探索一種簡便,有效且安全的轉染載體及途徑,為角膜相關疾病的基因治療提供實驗基礎。 方法:Lenti-EGFP通過兩種不同方法體內轉染大鼠角膜基質細胞,途徑1:將Lenti-EGFP病毒液通過微量進樣器直接注射進角膜基質;途徑2:刮除角膜上皮,基質層敷貼浸帶有等量lenti-EGFP病毒液的棉片。轉染后定期裂隙燈檢查,觀察角膜綠色熒光的表達及外眼情況,以3d、7d、26d、48d四個不同時間點收集角膜,固定后切片,進行HE染色,觀察角膜各層細胞的大體形態(tài);共聚焦顯微鏡觀察拍照,了解角膜熒光表達的強度、持續(xù)時間及分布情況;電鏡觀察基質細胞超微結構的變化;細胞凋亡檢測,了解試驗組與對照組角膜細胞凋亡情況。 結果:1.裂隙燈古蘭光下見轉染lenti-EGFP的活體大鼠角膜成藍綠色,對照組角膜未見熒光表達。2.HE染色顯示各組別大鼠角膜的各層細胞形態(tài)未發(fā)生明顯異常改變,電鏡見實驗組角膜基質細胞的超微結構未發(fā)生變異。3.共聚焦顯微鏡下觀察見:轉染lenti-EGFP的角膜基質細胞2d后增強型綠色熒光蛋白(EGFP)開始表達,7d時熒光表達到高峰,全層角膜均可見熒光表達,26d時表達明顯減弱,48d時僅是上皮有微弱表達;空質粒組在第3d和7d時角膜上皮及基質層間可見微弱熒光,基質細胞中無熒光表達,26d和48d時角膜已無熒光表達;對照組的全層角膜在各時間段均未見熒光表達。4.Tunel檢測發(fā)現(xiàn)實驗組的角膜上皮及基質細胞凋亡率較正常組高,但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論:Lenti-EGFP通過上述兩種體內轉染途徑均可安全有效的轉染活體大鼠角膜基質細胞。在轉染初期,注射法的EGFP基因表達更強,隨著時間的延長兩種方式的熒光強度趨于相同,但基質注射途徑仍略強于刮除上皮敷貼棉片這種方式。兩種技術操作簡便、基因轉染快速,且轉染效率較高、安全性好,為各種原因導致的角膜病變,尤其是對抑制準分子激光術后角膜Haze形成及板層角膜移植術后的排斥反應等轉基因治療提供了新思路。
[Abstract]:Objective: to investigate the efficacy and safety of lenti-EGFP gene mediated by lentivirus in rat corneal stromal cells. Effective and safe transfection vectors and pathways provide experimental basis for gene therapy of corneal related diseases. Methods Twenty Lenti-EGFP methods were used to transfect rat corneal stromal cells in vivo. Route 1: Lenti-EGFP virus solution was injected directly into corneal stroma through microsampler, and route 2: corneal epithelium was scraped and stromal layer was coated with cotton flakes containing the same amount of lenti-EGFP virus solution. After transfection with slit lamp, the expression of green fluorescence in cornea and the condition of external eye were observed. The cornea were collected at 4 different time points (3 days, 7 days, 26 days, 48 days), fixed sections were stained with HE, and the gross morphology of the cells in each layer of cornea was observed. The intensity, duration and distribution of fluorescence expression in cornea were observed by confocal microscope. Ultrastructural changes of stromal cells were observed by electron microscope. Apoptosis was detected in experimental group and control group. The result is 1: 1. Under slit lamp Gulan light, the cornea of living rats transfected with lenti-EGFP became blue-green, while that of control group showed no fluorescence expression .2.HE staining showed that the morphology of all layers of cornea in each group did not change abnormally. The ultrastructure of corneal stromal cells in the experimental group was not changed. Under confocal microscope, the expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP) reached its peak at 7 days after transfection of lenti-EGFP into corneal stromal cells. Fluorescence expression was observed in the whole cornea at day 26, and the expression was weakly expressed in the epithelium at the 48d, and between the epithelium and the stroma on the 3rd and 7th day in the blank plasmid group, and there was weak fluorescence between the epithelium and the stromal layer in the blank plasmid group. No fluorescent expression was found in the stromal cells at day 26 and day 48, but no fluorescence expression was found in the whole cornea of the control group. 4. Tunel analysis showed that the apoptosis rate of corneal epithelium and stromal cells in the experimental group was higher than that in the normal group. But there was no significant difference between the control group and the control group (P 0.05). ConclusionTwo percent Lenti-EGFP can be used to transfect rat corneal stromal cells safely and effectively through the two in vivo transfection pathways. In the early stage of transfection, the EGFP gene expression was stronger, and the fluorescence intensity of the two methods tended to be the same with time, but the matrix injection pathway was still slightly stronger than that of scraping epithelium coated cotton flakes. The two techniques are easy to operate, rapid gene transfection, high transfection efficiency and good safety. In particular, it provides a new way to inhibit the formation of corneal Haze and the rejection of lamellar keratoplasty after excimer laser surgery.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R779.63

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本文編號：1901942