本文選題：腺病毒 + 轉(zhuǎn)分化　； 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：再生醫(yī)學(xué)的首要目的是生成可以替代受損組織的細胞,在這方面有諸多非常具有創(chuàng)新性的研究。2006年誘導(dǎo)多能干細胞的成功生成是細胞生物學(xué)以及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里程碑式的進步,為再生醫(yī)學(xué)研究清除了多年來面臨的倫理障礙。最近的研究在此基礎(chǔ)上,成功實現(xiàn)了一個更加大膽的理念,即一種分化成熟的細胞直接轉(zhuǎn)分化為另外一種分化成熟的細胞。比如易于取材的皮膚成纖維細胞,已經(jīng)成功轉(zhuǎn)分化為心肌細胞,肝臟細胞,神經(jīng)元等。這些轉(zhuǎn)分化所得的細胞可以回植入機體,實現(xiàn)患者個體化細胞替代療法,避免排斥反應(yīng)。本研究擬采用非基因組整合性的腺病毒,實現(xiàn)皮膚成纖維細胞向神經(jīng)元及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞的轉(zhuǎn)分化。 第一部分 利用腺病毒將小鼠成纖維細胞直接轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元 中文摘要 目的：利用腺病毒作為載體,過表達神經(jīng)元相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,使小鼠胚胎成纖維細胞和成年成纖維細胞直接轉(zhuǎn)分化為具有功能的神經(jīng)元。 方法：神經(jīng)元相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Ascl1,Brn2,Mytl1和Ngn2分別被構(gòu)建入pAd/CMV/V5-DEST7.3腺病毒載體中,通過轉(zhuǎn)染293A細胞系,包裝出高滴度的帶有外源基因的腺病毒。C57BL/6J小鼠胚胎期E13.5天的胚胎背部成纖維細胞及成年6～8周C57BL/6J小鼠的耳尖成纖維細胞分別被不同組合的腺病毒Ascl1+Brn2+Myt11(ABM)或Ascl1+Brn2+Ngn2(ABN)感染。感染后13天到30天期間,利用免疫組織化學(xué)方法觀察神經(jīng)元的產(chǎn)生,以及不同神經(jīng)元標記物的表達,并通過電流鉗和電壓鉗方法檢測轉(zhuǎn)分化得到的神經(jīng)元的電生理特性。最后,利用PCR及核酸雜交方法,檢測腺病毒所攜帶的外源基因和載體片段在被感染細胞基因組內(nèi)的整合情況。 結(jié)果：兩種腺病毒組合ABM和ABN都能將胚胎成纖維細胞直接轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元。在感染后13天對細胞進行Tuj1免疫組織化學(xué)染色,在ABN組有2.94%±0.73%的胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元,在ABM組有1.64%士0.59%的胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元,ABN和ABM組產(chǎn)生的神經(jīng)元都可以發(fā)放動作電位。ABN組產(chǎn)生的神經(jīng)元可以表達多種神經(jīng)元特有的標記物,如Map2a,NeuN和Synapsin;通過更長時間的培養(yǎng)(20-25天),還可以檢測到興奮性神經(jīng)元標記物vGLUT和抑制性神經(jīng)元標記物GAD67的表達。通過與大鼠皮層神經(jīng)元的共培養(yǎng),轉(zhuǎn)分化產(chǎn)生的神經(jīng)元還可以檢測到興奮性突觸后電流。利用ABN組合感染小鼠成年成纖維細胞,兩周后同樣檢測到了Tuj1陽性的神經(jīng)元,并且轉(zhuǎn)分化所得的神經(jīng)元同樣具有原代培養(yǎng)神經(jīng)元特有的電生理特性。PCR和核酸雜交結(jié)果顯示,感染后的胚胎成纖維細胞的基因組中未發(fā)現(xiàn)外源基因及腺病毒載體片段的整合。 結(jié)論：利用腺病毒作為載體,過表達Ascl1,Brn2及Ngn2,可以成功地將小鼠胚胎成纖維細胞和成年成纖維細胞直接轉(zhuǎn)分化為有功能的神經(jīng)元,并且所得細胞未發(fā)現(xiàn)外源基因及腺病毒載體片段的整合。腺病毒介導(dǎo)的直接轉(zhuǎn)分化過程更加安全,具有更加廣闊的臨床應(yīng)用前景。 第二部分： 利用腺病毒將小鼠成纖維細胞直接轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞 中文摘要 目的：利用腺病毒作為載體,過表達視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,使小鼠胚胎成纖維細胞和成年成纖維細胞直接轉(zhuǎn)分化為具有功能的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞。方法：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)育相關(guān)基因Ascl1,Brn2,Ngn2,Ath5,Brn3b, Nf1和Pax6分別被構(gòu)建入pAd/CMV/V5-DEST7.3腺病毒載體中,通過轉(zhuǎn)染293A細胞系,包裝出高滴度的帶有外源基因的腺病毒。通過7種基因的不同分組感染C57BL/6J小鼠胚胎期E13.5天的背部成纖維細胞,利用Tuj1和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞特異性標記物的雙重染色,篩選出最有效的轉(zhuǎn)錄因子組合。對轉(zhuǎn)分化得到的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞進行多重標記物染色,并利用膜片鉗技術(shù)檢測這些細胞的電生理特性。利用相同的轉(zhuǎn)錄因子組合感染小鼠成年成纖維細胞,檢測多種視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞特異性標記物的表達情況,以及轉(zhuǎn)分化所得視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞的電生理特性。最后,利用PCR方法,檢測腺病毒所攜帶的外源基因在被感染細胞基因組內(nèi)的整合情況。 結(jié)果：經(jīng)過篩選,Asc1+Brn3b+Ngn2組合可以將小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞。這種轉(zhuǎn)分化所得的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞可以同時表達多種視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞特異性標記物,并且具有成熟神經(jīng)元的電生理特性。不同的標記物標記的轉(zhuǎn)發(fā)化效率大致一致,在3.58%-4.00%之間。Asc1+Brn3b+Ngn2組合還可以將小鼠成年成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞,同樣具有成熟神經(jīng)元的電生理特性。通過PCR的檢測驗證轉(zhuǎn)分化過程未發(fā)生外源基因在宿主基因組中的整合。 結(jié)論：利用腺病毒作為載體,攜帶Asc1+Brn3b+Ngn2轉(zhuǎn)錄因子組合,可以有效地將小鼠胚胎成纖維細胞及成年成纖維細胞直接轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞,轉(zhuǎn)分化所得的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)樣細胞具有成熟神經(jīng)元的電生理特性,并且可以同時表達多種視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞特異性標記物。該轉(zhuǎn)分化過程快速,有效,且不伴有外源基因的插入,為青光眼及其他視神經(jīng)病變的研究和治療提供了新的思路。
[Abstract]:The primary aim of regenerative medicine is to produce cells which can replace the damaged tissues . In 2006 , there are a number of very innovative research . In 2006 , the successful generation of pluripotent stem cells was a milestone in the field of cell biology and regenerative medicine .

the first portion

Direct transfer of mouse fibroblast cells into neurons using adenovirus

Chinese abstract

Objective : To express neuron - related transcription factors by using adenovirus as a carrier , so that mouse embryonic fibroblasts and adult fibroblasts can be differentiated into functional neurons .

Methods : The neuron - related transcription factors A尾1 , Br2 , Mytl1 and Ngn2 were respectively constructed into pAd / CMV / V5 - DEST7.3 adenovirus vector .

Results : Both adenoviral combinations and ABN were able to transform embryonic fibroblasts directly into neurons . The neurons in ABN group were transformed into neurons by Tuj1 immunohistochemical staining . The neurons in ABN group could express various neuron - specific markers , such as Map2a , NeuN and Synapsin . The neurons in ABN group could express various neuron - specific markers , such as Map2a , NeuN and Synapsin .

Conclusion : Using adenovirus as a carrier , overexpression of A尾1 , Br2 and Ngn2 can successfully transfer mouse embryonic fibroblasts and adult fibroblasts into functional neurons , and the obtained cells do not find the integration of exogenous gene and adenovirus vector fragment . Adenovirus - mediated direct differentiation process is safer and has wider clinical application prospect .

Chinese abstract

Direct transformation of mouse fibroblast into retinal ganglion - like cells using adenovirus

Part Two :

Objective : To investigate the expression of specific markers of retinal ganglion cells and the electrophysiological properties of retinal ganglion - like cells . Methods : The expression of specific markers of retinal ganglion cells and the electrophysiological properties of retinal ganglion - like cells were determined by using the double staining of Tuj1 and retinal ganglion cell specific markers .

Results : After screening , the combination of Asc1 + Brn3b + Ngn2 could differentiate the mouse fibroblast into retinal ganglion - like cells . The retinal ganglion - like cells obtained by this differentiation could express various retinal ganglion cell - specific markers at the same time , and had the electrophysiological properties of mature neurons . The combination of Asc1 + Brn3b + Ngn2 could also transform adult fibroblasts into retinal ganglion - like cells , and also had the electrophysiological properties of mature neurons .

Conclusion : Using adenovirus as carrier and carrying Asc1 + Brn3b + Ngn2 transcription factor combination , the mouse embryonic fibroblasts and adult fibroblasts can be effectively transformed into retinal ganglion - like cells . The retinal ganglion - like cells obtained by transdifferentiation have the electrophysiological properties of mature neurons , and various retinal ganglion cell - specific markers can be expressed at the same time .

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R774.1

【共引文獻】

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本文編號：1859948