本文選題：人巨細(xì)胞病毒 + ARPE-19　； 參考：《青島大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的：研究人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19后對(duì)其細(xì)胞周期的影響,研究這種影響與HCMV IE86基因的相關(guān)性,探討HCMV感染導(dǎo)致巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎的發(fā)病機(jī)制。 方法：用HCMV感染同步化于Go/G1期的ARPE-19細(xì)胞作為感染組,同時(shí)設(shè)未感染組為對(duì)照組。于感染后1d、2d、3d、4d和5d收獲細(xì)胞,RT-PCR方法檢測(cè)HCMVIE72、IE86 mRNA水平的表達(dá),用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)HCMV IE蛋白的表達(dá),Western blot法檢測(cè)HCMV早期蛋白IE72、IE86和晚期蛋白pp65的表達(dá)。MTT法檢測(cè)病毒感染1-6天后對(duì)細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染組與未感染組細(xì)胞DNA含量的變化。Western blot法檢測(cè)病毒感染后細(xì)胞Cyclin D1、CyclinE表達(dá)的變化。采用PCR方法從質(zhì)粒pIEP86AD169擴(kuò)增出IE86基因片段,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3-IE86,脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞,RT-PCR、免疫熒光法分析IE86基因的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞DNA含量的變化。 結(jié)果：HCMV IE72的mRNA在病毒感染后第1天檢測(cè)到開始表達(dá),IE86的mRNA在感染后第3天檢測(cè)到開始表達(dá)；HCMV IE72、IE86和pp65蛋白可分別在病毒感染ARPE-19細(xì)胞2天、3天和5天時(shí)開始表達(dá)。MTT檢測(cè)顯示病毒感染3-6天后OD值分別為(0.646-0.0558)、(0.664±0.0765)、(0.723±0.1474)和(0.803±0.1073),與對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)示感染組在感染后第3天、4天、5天細(xì)胞周期的S期細(xì)胞比率為(21.78%±2.65%),(26.65%±0.71%),(31.80%±3.97%),與對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Cyclin D1在未感染細(xì)胞及病毒感染1-2天時(shí)高表達(dá),自感染3天起表達(dá)量開始下降。Cyclin E在未感染細(xì)胞及病毒感染1天時(shí)呈低表達(dá)狀態(tài),自感染第2天起表達(dá)量開始上升。 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N3-IE86后24小時(shí)可檢測(cè)到IE86在]mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后細(xì)胞周期中S期細(xì)胞比率為(20.74%±1.60%),與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：HCMV可感染ARPE-19細(xì)胞。HCMV可促同步化于Go/G1期的ARPE-19細(xì)胞進(jìn)入S期,且停滯于S期。IE86蛋白可以引起同步化于Go/G1期的ARPE-19細(xì)胞進(jìn)入S期,提示HCMV導(dǎo)致ARPE-19細(xì)胞周期的改變可能由HCMV的IE86蛋白引起。
[Abstract]:Aim: to study the effect of human cytomegalovirus (HCMV) on the cell cycle of human retinal pigment epithelial cells (ARPE-19), and to investigate the relationship between the effect and HCMV IE86 gene, and to explore the pathogenesis of cytomegalovirus retinitis caused by HCMV infection.Methods: HCMV infected ARPE-19 cells in Go/G1 phase were used as infection group and non-infected group as control group.RT-PCR was used to detect the expression of HCMV IE72nIE86 mRNA in the harvested cells on the 1st day, 2nd day, 3rd day and 5th day after infection.The expression of HCMV IE protein in cell nucleus was detected by immunofluorescence assay. The expression of HCMV early protein IE72 IE86 and late protein pp65 was detected by Western blot method. The effect of virus infection on cell proliferation was detected by MTT assay after 1-6 days of infection.The changes of DNA content in infected and uninfected cells were detected by flow cytometry. The expression of Cyclin D1 cyclin E was detected by Western blot assay.An eukaryotic expression plasmid pEGFP-N3-IE86 was constructed by amplification of IE86 gene fragment from plasmid pIEP86AD169 by PCR method, and transient transfection of ARPE-19 cell line RT-PCR was carried out by liposome. The expression of IE86 gene was analyzed by immunofluorescence.The changes of DNA content in plasmid transfected group and untransfected group were detected by flow cytometry.Results on the first day after virus infection, the mRNA of mRNA of IE72 was detected and the mRNA that began to express iE86 was detected. On the third day after infection, the expression of HCMV IE72, IE86 and pp65 protein began to express on the 2nd day and 5th day after the virus was infected with ARPE-19 cells, respectively, and the expression of pp65 protein began on the 2nd day and 5th day after the virus infection.The OD values were 0.664 鹵0.0765 鹵0.1474 and 0.803 鹵0.1073 respectively after 3-6 days of virus infection, which were compared with those of the control group.The difference was statistically significant (P 0.05).Flow cytometry showed that the S phase cell ratio of the infected group was 21.78% 鹵2.65% 鹵2.65% 鹵0.71% 鹵31.80% 鹵3.97% on the 3rd day after infection, and the difference was statistically significant compared with the control group. The expression of Cyclin D1 was significantly higher than that of the control group at 1-2 days after infection.The expression of Cyclin E began to decrease after 3 days of infection. The expression of Cyclin E began to increase on the second day of infection.The expression of IE86 at mRNA and protein levels was detected 24 hours after transient transfection of plasmid pEGFP-N3-IE86.The ratio of S phase cells in the cell cycle was 20.74% 鹵1.60% after transient transfection 48 hours after transfection, and the difference was statistically significant compared with the control group (P 0.05).ConclusionHCMV can infect ARPE-19 cells. HCMV can induce ARPE-19 cells synchronized in Go/G1 phase to enter S phase, and arrest in S phase. IE86 protein can induce ARPE-19 cells synchronized in Go/G1 phase to enter S phase.The results suggest that the change of ARPE-19 cell cycle induced by HCMV may be caused by the IE86 protein of HCMV.
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R774.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1768115