本文選題：炎性分子 + 高滲��； 參考：《濟南大學》2014年碩士論文

【摘要】：目的：通過體外使用炎性分子和高滲透壓處理小鼠角膜上皮干/祖細胞系（TKE2）和原代兔角膜緣干細胞，分別模擬持續(xù)性炎癥和干眼高滲因素，研究其對角膜上皮干細胞活性的不同影響及其可能的機制。 方法：1.體外角膜上皮干細胞模型的建立：（1）小鼠角膜上皮干/祖細胞系(TKE2)：采用含BPE和EGF的KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)；（2）原代兔角膜緣干細胞：新西蘭大白兔6只，耳緣靜脈空氣栓塞處死后剪取其眼球，無菌條件下Dispase-Trypsin/EDTA消化法分離獲得原代兔角膜緣干細胞，將細胞以1000個/孔的密度接種于6孔板中，采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。 2．炎性分子對角膜上皮干細胞活性的影響：用10ng/ml IFN-γ，IL-1β或TNF-α處理角膜上皮干細胞8天，篩選對細胞克隆形成能力影響較大的炎性分子。采用篩選出的IL-1β進行進一步研究，用不同濃度的IL-1β（0，1，5，10，20ng/ml）處理角膜上皮干細胞8天，檢測其對細胞克隆形成能力及細胞生存能力的影響。 3．高滲因素對角膜上皮干細胞活性的影響：通過不同濃度的NaCl（0，10，30，60，90mM）處理角膜上皮干細胞8天，檢測其對細胞克隆形成能力及細胞生存能力的影響。 4．炎性分子和高滲因素共同作用對角膜上皮干細胞克隆形成能力的影響：用10ng/ml IL-1β復合不同濃度的NaCl處理角膜上皮干細胞8天，檢測兩種不同因素的疊加對細胞克隆形成能力的影響。 5.炎性分子和高滲因素對角膜上皮干細胞活性影響的可能機制研究：通過研究IL-1β或NaCl處理對角膜上皮干細胞細胞凋亡和壞死、細胞周期分布、干細胞標志物表達及活性氧（ROS）水平等方面的影響來探討炎性分子和高滲因素對角膜上皮干細胞活性影響的可能機制。 結果：1．三種不同炎性分子處理TKE2細胞，發(fā)現(xiàn)與對照或IFN-γ處理相比，IL-β和TNF-α處理能顯著影響TKE2細胞的克隆形成能力和克隆集落大小。用不同濃度IL-1β或NaCl處理TKE2細胞發(fā)現(xiàn)，隨IL-1β和NaCl濃度的增加，TKE2細胞克隆形成率和集落直徑的減小呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應；且IL-1β或NaCl同樣能夠顯著影響兔原代角膜緣干細胞的克隆形成能力。而當IL-1β與不同濃度的NaCl共同處理TKE2細胞時，其克隆形成效率和集落直徑比單獨用IL-1β處理時減小的更為顯著。不同濃度IL-1β或NaCl處理TKE2細胞能夠不同程度的影響細胞的存活，其中高濃度的NaCl對細胞的存活影響更大。 2．高濃度的NaCl（60mM）會造成顯著的細胞凋亡和壞死，使細胞周期停滯在G2/M期；而IL-1β幾乎不造成細胞凋亡和細胞周期分布的改變。IL-1β和NaCl可下調(diào)TKE2細胞干細胞標記物ΔNp63的表達，且NaCl可明顯上調(diào)分化上皮細胞標記物involucrin的表達。IL-1β和NaCl處理均可升高TKE2細胞內(nèi)ROS的水平。 結論：1.炎性分子IL-1β可抑制角膜上皮干細胞的克隆形成能力。 2. NaCl模擬的高滲透壓微環(huán)境下，干細胞表現(xiàn)為早期凋亡甚至壞死，細胞周期阻滯。 3.炎性分子和高滲因素對角膜上皮干細胞活性的影響可能與其過度活化細胞內(nèi)ROS的水平相關。
[Abstract]:Objective : To study the effects of inflammatory and high osmotic pressure on corneal epithelial stem / progenitor cell line ( TKE2 ) and primary rabbit corneal limbal stem cells in vitro .

Methods : 1 . Establishment of the model of corneal epithelial stem cells in vitro : ( 1 ) Mouse corneal epithelial stem / progenitor cell line ( TKE2 ) : cultured with the culture medium containing BPE and EGF ;
( 2 ) The corneal limbal stem cells of the primary rabbit : 6 rabbits in New Zealand white rabbits , after the ear marginal venous air embolism were killed , the eyeball was cut and the corneal limbal stem cells of the primary rabbit were separated under sterile conditions . The cells were inoculated into 6 - well plates at a density of 1000 cells / well , and cultured in DMEM / F12 medium containing 10 % fetal bovine serum .

2 . The effect of inflammatory molecules on corneal epithelial stem cell activity was studied by using 10 ng / ml IFN - 緯 , IL - 1尾 or TNF - 偽 in the treatment of corneal epithelial stem cells for 8 days . The results showed that IL - 1尾 ( 0 , 1 , 5 , 10 , 20 ng / ml ) was used to treat corneal epithelial stem cells for 8 days . The effects of different concentrations of IL - 1尾 ( 0 , 1 , 5 , 10 , 20 ng / ml ) on the formation of cell clones and cell viability were examined .

3 . The effect of hyperosmotic factors on corneal epithelial stem cell activity was studied by treating corneal epithelial stem cells with different concentrations of NaCl ( 0 , 10 , 30 , 60 , 90 mM ) for 8 days .

4 . The effects of inflammatory and hyperosmotic factors on the formation of corneal epithelial stem cell clones were studied . The effects of two different factors on the formation of corneal epithelial stem cells were studied by treating corneal epithelial stem cells with 10 ng / ml IL - 1尾 compound at different concentrations for 8 days .

5 . Possible mechanisms of inflammatory and hyperosmotic factors on corneal epithelial stem cell activity : The possible mechanism of inflammatory and hyperosmotic factors on corneal epithelial stem cell activity was investigated by investigating the effects of IL - 1尾 or NaCl on corneal epithelial stem cell apoptosis and necrosis , cell cycle distribution , stem cell marker expression and reactive oxygen ( ROS ) levels .

Results : 1 . TKE2 cells were treated with three different inflammatory molecules . Compared with control or IFN - 緯 treatment , IL - 1尾 and TNF - 偽 treatment could significantly affect the clonal formation and colony size of TKE2 cells .
When IL - 1尾 and NaCl were treated with different concentrations of NaCl to deal with TKE2 cells , the colony forming efficiency and colony diameter were more significant than that of IL - 1尾 alone . Different concentrations of IL - 1尾 or NaCl treated TKE2 cells could influence the survival of the cells in different degrees , and the high concentration of NaCl had a greater effect on the survival of the cells .

2 . High concentration of NaCl ( 60 mM ) can cause significant apoptosis and necrosis , and the cell cycle arrest in G2 / M phase ;
IL - 1尾 and NaCl could down - regulate the expression of the marker 螖Np63 of TKE2 cell stem cell marker , and NaCl could significantly increase the expression of the differentiation epithelial cell marker 螖Np63 . Both IL - 1尾 and NaCl treatment could increase the level of ROS in TKE2 cells .

Conclusion : 1 . IL - 1尾 can inhibit the formation of corneal epithelial stem cells .

2 . Under the high osmotic pressure microenvironment of NaCl simulation , the stem cells showed early apoptosis or even necrosis and cell cycle arrest .

3 . The influence of inflammatory molecules and hyperosmotic factors on corneal epithelial stem cell activity may be related to the level of ROS in over - activated cells .

【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R772.2

【共引文獻】

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