本文選題：先天性小耳畸形　切入點(diǎn)：維甲酸　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2011年博士論文

【摘要】：目的：通過(guò)觀察維甲酸干預(yù)后耳廓軟骨細(xì)胞增殖及基因表達(dá)的情況,并比對(duì)正常耳廓軟骨細(xì)胞增殖及基因表達(dá)的情況,分析維甲酸對(duì)耳廓軟骨細(xì)胞性狀的影響及維甲酸作用的具體分子機(jī)制和主要通路,探討維甲酸導(dǎo)致先天性小耳畸形的發(fā)病機(jī)制,并進(jìn)一步通過(guò)觀察維甲酸對(duì)大鼠胚胎發(fā)育的影響,為建立維甲酸誘導(dǎo)先天性小耳畸形動(dòng)物模型積累經(jīng)驗(yàn)。 方法： 1、取耳廓軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng),培養(yǎng)液中分別加入不同濃度維甲酸,通過(guò)MTT法繪制軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,觀察維甲酸對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)觀察維甲酸對(duì)軟骨細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志性基因表達(dá)的影響,探討維甲酸對(duì)耳廓軟骨性狀的影響。 2、取耳廓軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng),對(duì)照組正常培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組加入維甲酸,培養(yǎng)48小時(shí)后取軟骨細(xì)胞RNA進(jìn)行全基因組表達(dá)芯片檢測(cè),分析維甲酸對(duì)軟骨細(xì)胞全基因組表達(dá)的影響,并通過(guò)Gene Ontology方法分析維甲酸對(duì)軟骨細(xì)胞作用的靶基因、生物學(xué)過(guò)程、分子功能、細(xì)胞成分等信息。通過(guò)Pathway方法構(gòu)建基于信號(hào)通路的基因相互作用網(wǎng)絡(luò),探討維甲酸導(dǎo)致先天性小耳畸形的具體機(jī)制,為進(jìn)一步研究維甲酸導(dǎo)致先天性畸形的分子基礎(chǔ)提供依據(jù)。。3、通過(guò)腹腔注射法在孕13.5天對(duì)Wistar孕大鼠應(yīng)用維甲酸干預(yù),于孕20天剖腹取大鼠胚胎,觀察維甲酸對(duì)大鼠胚胎發(fā)育的影響,為建立維甲酸誘導(dǎo)先天性小耳畸形大鼠模型摸索經(jīng)驗(yàn)。 結(jié)果 1、維甲酸干預(yù)可降低耳廓軟骨細(xì)胞的增殖速度,并且具有時(shí)間和劑量依賴性,與正常耳廓軟骨細(xì)胞相對(duì)照,0.5*10-6mol/L濃度維甲酸在第七天,1*10-6mol/L濃度維甲酸在第二天即可降低軟骨細(xì)胞的增殖速度,研究組與對(duì)照組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2.1*10-6mol/L濃度維甲酸干預(yù)耳廓軟骨細(xì)胞48小時(shí)后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞標(biāo)志物Col2A1的表達(dá)降低了53%,Col10A1降低了43%,與軟骨細(xì)胞性狀相關(guān)的基因ALP的表達(dá)降低了43%,Runx2降低了29%。運(yùn)用Prizm 4統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行T-test分析,Col10A1和ALP在處理組的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組具有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0001).Co12A1和Runx2的表達(dá)在處理中也有降低的趨勢(shì),但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3、相對(duì)正常對(duì)照,1*10-6mol/L濃度維甲酸干預(yù)耳廓軟骨細(xì)胞48小時(shí)導(dǎo)致多個(gè)基因表達(dá)改變,差異基因功能集中于細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移及細(xì)胞周期等多方面,通過(guò)統(tǒng)計(jì)及基因功能分析,篩選出多個(gè)候選基因：Cyp26A1、Cyp26B1、RARRES3、RARRES1、NANOS1、SNAI2、MGP、DAPK-1、SOX4、PLK2、CCNA2、ATP5H等。GO分析和Pathway分析顯示維甲酸通過(guò)多種通路及途徑對(duì)耳廓軟骨細(xì)胞施加影響。對(duì)比相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)維甲酸作用具有組織特異性。 4、維甲酸干預(yù)可對(duì)大鼠胚胎發(fā)育產(chǎn)生不良影響,包括發(fā)育停滯、死亡及多種先天性畸形,其中存在外耳發(fā)育異常。相比胃管灌注法,腹腔注射法所用劑量應(yīng)適當(dāng)調(diào)整。 結(jié)論： 1、維甲酸可抑制耳廓軟骨細(xì)胞的增殖,其作用具有時(shí)間和劑量依賴性,并對(duì)軟骨細(xì)胞性狀造成一定的不良影響。 2、維甲酸對(duì)耳廓軟骨細(xì)胞基因表達(dá)的影響顯示,維甲酸導(dǎo)致先天性小耳畸形的作用機(jī)制一是通過(guò)干擾多種途徑和通路干預(yù)外耳發(fā)育,二是通過(guò)干擾與發(fā)育相關(guān)的多種基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)而影響外耳軟骨的發(fā)育。 3、維甲酸干預(yù)可對(duì)大鼠胚胎發(fā)育造成多種不良影響,其中包括外耳發(fā)育異常,但建立穩(wěn)定的先天性小耳畸形大鼠模型所需的維甲酸干預(yù)的途徑、劑量及時(shí)機(jī)均有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Objective: through the proliferation and gene expression of cartilage cell by retinoic acid after intervention, and compared the expression of proliferation of normal cartilage cell and gene analysis, the molecular mechanism of retinoic acid effects on cartilage cell traits and retinoic acid and retinoic acid on main pathway, resulting in congenital microtia malformation pathogenesis, and further through the effect of retinoic acid on rat embryonic development, for the establishment of retinoic acid induced congenital microtia animal model of the accumulation of experience.
Method錛，

本文編號(hào)：1662491