本文選題：人角膜內皮細胞系　切入點：轉化生長因子β2　出處：《中國海洋大學》2010年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 角膜內皮細胞是存在于角膜靠近于房水面的六角形鑲嵌排列的單層細胞,對維持角膜的透明有著關鍵作用。成年人角膜內皮細胞(HCEC)缺乏增殖能力,局部細胞受到損傷后,只能通過鄰近細胞體積的增大和移行來填補缺損區(qū),所以六角形HCEC的數量逐年減少,角膜透明度逐漸降低�，F有研究結果表明,HCEC停留在細胞周期的早G1期,仍然保持有增殖的潛能。但關于HCEC停留在G1期的具體的細胞與分子機制,至今仍不清楚。 轉化生長因子β(TGF-β)屬于TGF-β超家族的成員,具有調控細胞的增殖、分化、凋亡及組織的損傷后修復等作用。TGF-β2是存在于人房水中的主要的TGF-β類型,可促進小鼠角膜上皮層和基質層的正常發(fā)育及內皮層的形成,抑制體外培養(yǎng)的大鼠、兔和牛角膜內皮細胞的增殖、調控牛角膜內皮細胞外基質蛋白的合成以及角膜內皮細胞的損傷后修復。有關TGF-β2對HCEC增殖活性和形態(tài)的影響及相關的分子機理,至今還未見到相關的報道。 為了探明TGF-β2對HCEC增殖活性的影響及相關的細胞和分子機理,本文利用體外培養(yǎng)的人角膜內皮細胞系,使用不同濃度的TGF-β2在含10%FBS的DMEM/F12的培養(yǎng)條件下處理HCEC,發(fā)現1-15ng/mL的TGF-β2對HCEC的增殖均有抑制作用,在1～9ng/mL的濃度范圍內,TGF-β2對HCEC增殖的抑制作用具有濃度依賴性,其中9ng/mL為TGF-β2對HCEC增殖的峰值抑制濃度；9ng/mL的TGF-β2處理HCEC的細胞計數結果顯示,TGF-β2處理12h即可抑制HCEC的增殖,抑制作用具有時間依賴性；流式細胞儀檢測結果顯示,9ng/mL TGF-β2處理后,處于G1/G0期HCE細胞的數量顯著增加(P0.05),并具有時間依賴性。熒光定量PCR結果顯示,9ng/mLTGF-β2處理24 h后,HCEC對p27kip1的表達量顯著增加,48 h后P27kip1和p21cip1的表達量均顯著增加,也具有時間依賴性。以上結果說明,TGF-β2對HCEC具有顯著的增殖抑制作用,并具有濃度和時間依賴性,其抑制作用機理很可能是通過先后誘導p27kip1和p21cip1表達量的增加進而將細胞拘留在G1/G0期來實現的。 為了探明TGF-β2對HCEC形態(tài)的影響及相關的分子機理,本文首先采用1～15ng/mL的TGF-β2在含10%FBS的DMEM/F12的培養(yǎng)條件下處理HCEC,光學顯微鏡下觀察的結果顯示,3～15ng/mL的TGF-β2處理72h可明顯增加細胞的貼瓶面積,在3-9 ng/mL的濃度范圍內,TGF-β2對HCEC形態(tài)改變具有濃度依賴性,其中9ng/mL為TGF-β2對HCEC形態(tài)的峰值改變濃度；9ng/mL的TGF-β2處理HCEC的光鏡觀察結果顯示,TGF-β2處理HCEC 24h即可增加單個細胞的鋪展面積,促進細胞由上皮細胞樣變?yōu)槌衫w維細胞樣,形態(tài)的改變具有時間依賴性；細胞貼附實驗表明,9ng/mL TGF-β2處理24h-72h均可明顯的增強HCEC貼附能力(P0.05)。熒光雙染色結果顯示,9ng/mL TGF-β2處理24h,可增加HCEC胞質中F-肌動蛋白絲和微管的長度,降低細胞中心體區(qū)域的熒光強度；處理72h則明顯增加HCEC胞質中微絲束的數量和長度,并促進微管遍布于整個胞質空間；HCECⅠ型和Ⅳ型膠原的免疫熒光染色的結果顯示,9ng/mL TGF-β2處理72h,可明顯增加HCEC單個細胞胞外Ⅳ型膠原的鋪展面積,降低其熒光強度；Western blot結果顯示,9ng/mL TGF-β2處理24h和72h對HCEC I型膠原和Ⅳ型膠原的表達量均沒有顯著的影響。以上結果說明,TGF-β2通過增加平行于細胞長軸方向的F-肌動蛋白絲的數量、延長F-肌動蛋白絲和微管的長度以及增加Ⅳ型膠原的鋪展面積,從而促進HCEC由上皮細胞樣向成纖維細胞樣的轉變、增大單個細胞的鋪展面積和增強細胞的貼附能力。 本文研究了TGF-β2對體外培養(yǎng)的人角膜內皮細胞的增殖活性和形態(tài)影響作用,旨在探明TGF-β2在人角膜內皮細胞的增殖和形態(tài)改變中的作用及其相關的細胞和分子機理,為深入研究人角膜內皮細胞增殖調控的機理提供重要的理論支持,對了解TGF-β2在角膜內皮細胞的損傷修復過程中的作用具有重要的理論意義。
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【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R772.21

【參考文獻】

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本文編號：1632944