本文選題：下咽鱗狀細(xì)胞癌　切入點(diǎn)：自噬　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：下咽鱗狀細(xì)胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma, HSCC)是頭頸部較常見(jiàn)的一種惡性腫瘤,發(fā)病率約占頭頸癌的5%。早期癥狀主要表現(xiàn)為咽部異物感、吞咽梗阻感,隨著瘤體增大,表面發(fā)生破潰,可引起吞咽疼痛、并出現(xiàn)同側(cè)反射性耳痛,常伴有進(jìn)行性吞咽困難,累及喉腔可引起聲音嘶啞、呼吸困難等癥狀。因下咽癌中95%以上為鱗狀細(xì)胞癌,大多數(shù)分化程度較差,易粘膜下浸潤(rùn)擴(kuò)散,早期臨床癥狀不明顯,所以,在臨床就診時(shí)多數(shù)患者的病變已累及舌根、喉腔和頸段食道等部位,并多伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。近年來(lái)隨著頭頸外科診療技術(shù)的不斷發(fā)展,多種不同方法例如手術(shù)治療、放射治療、化療藥物治療以及三種療法相結(jié)合綜合抗癌治療的應(yīng)用,HSCC患者生存率有所改善,但Ⅲ-Ⅳ期患者5年生存率仍僅為25%-40%。因此,深入研究HSCC的生物學(xué)特征,并在此基礎(chǔ)上尋找腫瘤特異性標(biāo)志物以及探索新的診療方法成為目前亟須解決的課題。 自噬(autophagy)是細(xì)胞漿中出現(xiàn)大量由細(xì)胞膜包裹著部分胞質(zhì)和細(xì)胞器的空泡結(jié)構(gòu)(自噬體),溶酶體對(duì)空泡內(nèi)的成分進(jìn)行消化降解,并轉(zhuǎn)變?yōu)闄C(jī)體所需的能量物質(zhì)從而循環(huán)再利用的一種生物學(xué)現(xiàn)象。目前自噬至少可以分為三種形式,分別是微自噬、巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬,通常我們所指的自噬為巨自噬。近年來(lái)研究表明自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,其對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制一直存在著爭(zhēng)議,自噬可在營(yíng)養(yǎng)剝奪的條件下促進(jìn)細(xì)胞的存活,起到保護(hù)細(xì)胞的作用,但在一定刺激條件下自噬被誘導(dǎo)時(shí)卻可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 目前在酵母中已經(jīng)鑒別出大約30個(gè)特定基因參與自噬調(diào)控,其中人類(lèi)同源的有16個(gè),在這些基因中, Beclin1和LC3(microtubule-associated protein1A/1B-lightchain3,微管相關(guān)蛋白1輕鏈3)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。Beclin1是酵母Atg6/Vps30基因在哺乳動(dòng)物中的同源類(lèi)似物,主要通過(guò)與ClassIIIPI3K形成復(fù)合物參與自噬體的形成。Liang等人報(bào)道了在乳腺癌組織中Beclin1表達(dá)水平顯著降低,將Beclin1轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF7細(xì)胞株造成Beclin1穩(wěn)定高表達(dá),從而抑制癌細(xì)胞體外增殖活性,在體內(nèi)試驗(yàn)中裸鼠成瘤能力也明顯受到抑制,因此,Beclin1在人乳腺癌中具有抑癌作用。Clelia等研究揭示了在人惡性黑色素瘤細(xì)胞中Beclin1蛋白表達(dá)水平較正常皮膚黑素細(xì)胞顯著降低。此外,Beclin1表達(dá)下調(diào)預(yù)示著自噬缺陷,與肝癌的惡性表型和預(yù)后不良密切相關(guān)。在卵巢癌、肺癌和腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤等實(shí)體瘤中同樣也存在Beclin1等位基因的缺失。但是,在已觀察到的95%腸癌和83%胃癌中Beclin1表達(dá)水平卻明顯增高,具有致癌的作用,由此可見(jiàn)Beclin1在不同腫瘤中發(fā)揮的作用各不相同。 LC3(microtubule-associated protein1A/1B-light chain3,微管相關(guān)蛋白1輕鏈3)是酵母Atg8基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的同源物,經(jīng)Atg7和Atg3調(diào)節(jié)由泛素樣加工修飾。LC3有三種亞型,包括LC3A、LC3B和LC3C, LC3由可溶型LC3-Ⅰ和脂化型LC3-Ⅱ組成,其分子量分別18kd和16kd。在面臨各種應(yīng)激情況下,例如缺氧、饑餓和化學(xué)藥物作用下,細(xì)胞自噬被誘導(dǎo),LC3-Ⅰ經(jīng)泛素樣加工和修飾,與膜表面的脂酰乙醇胺(PE)相結(jié)合成LC3-Ⅱ,其中LC3-Ⅰ存在于細(xì)胞漿,脂化的LC3-Ⅱ與自噬泡相結(jié)合,定位于胞內(nèi)前自噬泡和自噬體膜表面。因此,LC3-II的含量與自噬泡的數(shù)量成正比,當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí),LC3-Ⅱ上調(diào)。目前通過(guò)檢測(cè)胞內(nèi)LC3-Ⅱ表達(dá)的變化,從而可以判斷自噬的狀態(tài),LC3-Ⅱ已被作為監(jiān)測(cè)自噬活性的特異性標(biāo)志物。Aoki等報(bào)道了Anti-LC3B抗體可以作為檢測(cè)腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系和組織中自噬的有效工具。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)LC3在肺癌和宮頸鱗狀細(xì)胞癌中呈現(xiàn)低表達(dá)并與患者預(yù)后不良相關(guān),在這些腫瘤中LC3主要發(fā)揮抑癌作用。但在食道和胃腸道惡性腫瘤中LC3表達(dá)水平顯著增高,提示可能起到促癌的作用。提示LC3在不同腫瘤中發(fā)揮的作用具有組織特異性。 目前尚沒(méi)有關(guān)于自噬相關(guān)基因在HSCC中表達(dá)及其作用的研究,在本項(xiàng)課題中,我們分別從mRNA、蛋白水平檢測(cè)了自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3在HSCC腫瘤組織和癌旁非腫瘤粘膜組織中的表達(dá)情況,并對(duì)病人進(jìn)行追蹤和術(shù)后隨訪,進(jìn)一步分析研究Beclin1、LC3表達(dá)與下咽癌臨床分期、病理分型以及疾病預(yù)后之間的關(guān)系。利用小干擾RNA技術(shù)在人下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞系中敲掉Beclin1,體外檢測(cè)自噬相關(guān)基因Beclin1低表達(dá)對(duì)FaDu細(xì)胞凋亡、增殖和轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響。 第一部分下咽鱗狀細(xì)胞癌中自噬相關(guān)基因Beclinl和LC3的表達(dá)及其臨床意義 研究目的： 研究自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3在下咽鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況,并分析Beclin1和LC3表達(dá)與患者臨床病理特征以及預(yù)后之間的關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)方法 1.手術(shù)中收集82例HSCC腫瘤組織樣本和54例距腫瘤手術(shù)切緣2cm以上形態(tài)學(xué)正常的癌旁非腫瘤粘膜上皮組織樣本。 2.采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)Beclin1和LC3分別在82例腫瘤樣本和54例癌旁非腫瘤粘膜樣本中的表達(dá)。 3. TRIzol法用來(lái)提取54對(duì)相互配對(duì)的腫瘤組織和癌旁非腫瘤粘膜組織中總RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用Real-time PCR方法比較在配對(duì)樣本中Beclin1.. LC3mRNA水平上的表達(dá)差異。 4.使用蛋白裂解液從組織樣品中提取總蛋白,應(yīng)用Western Blot方法在蛋白水平上定量檢測(cè)Beclin1和LC3在腫瘤組織和相對(duì)照的癌旁非腫瘤粘膜組織中的表達(dá)情況。 5.應(yīng)用GraphPad Prism5.0和SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。Beclin1和LC3相對(duì)表達(dá)量用mean±SEM表示,配對(duì)Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)被應(yīng)用于比較腫瘤組織與配對(duì)癌旁非腫瘤粘膜組織中Beclin1和LC3表達(dá)的差異。應(yīng)用Spearman檢驗(yàn)?zāi)[瘤組織中Beclin1和LC3之間的相關(guān)性,Beclin1、LC3的表達(dá)與HSCC臨床病理特征之間關(guān)系的分析采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。采用非參數(shù)Kaplan-Meier分析法繪制生存曲線,其差異分析采用log-rank檢驗(yàn)。應(yīng)用多因素Cox回歸模型分析影響HSCC患者生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均為雙側(cè),P0.05時(shí)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示Beclin1陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì),但主要表達(dá)在細(xì)胞膜。LC3陽(yáng)性表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,極少量表達(dá)在細(xì)胞膜。Beclin1在79.6%(43/54)的癌旁非腫瘤粘膜組織中表達(dá)陽(yáng)性,但僅在42.7%(35/82)的腫瘤組織樣本中陽(yáng)性表達(dá)(P0.0001)。LC3在74.1%(40/54)的癌旁非腫瘤粘膜組織樣本中高表達(dá),而僅在41.5%(34/82)的腫瘤組織樣本中呈現(xiàn)出高表達(dá)(P=0.0002)。Beclin1和LC3在HSCC腫瘤組織中的表達(dá)顯著低于相對(duì)照的癌旁非腫瘤粘膜組織。 2. Real-time PCR結(jié)果顯示Beclin1mRNA水平在腫瘤組織中相對(duì)表達(dá)量為(0.016±0.004),明顯低于配對(duì)的癌旁非腫瘤粘膜組織(0.024±0.005,P0.0001)。LC3-Ⅱ mRNA水平在腫瘤組織和癌旁非腫瘤粘膜組織中相對(duì)表達(dá)量均值分別為(0.154±0.053)和(0.242±0.083),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：與癌旁非腫瘤粘膜組織相比,LC3-Ⅱ mRNA水平在腫瘤組織中的表達(dá)顯著降低(P=0.0001)。此外Beclin1和LC3-Ⅱ在腫瘤組織中存在正相關(guān)性(r=0.51,P0.0001；95%CI：0.273to0.689)。 3. Western blot結(jié)果表明Beclin1在腫瘤組織樣本中蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量為(0.308±0.031),明顯低于在癌旁非腫瘤粘膜組織中的表達(dá)(0.569±0.068,P＝0.02)。LC3-Ⅱ蛋白水平在腫瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量是(0.289±0.034),顯著低于相對(duì)照的非腫瘤粘膜組織(0.685±0.076,P=0.004)。 4.Beclin1陰性表達(dá)與腫瘤高等級(jí)的臨床分期(r=0.299,P＝0.005)、腫瘤大小(r=0.365,P=0.0004)、較低的分化程度(r=0.392,P＝0.0006)和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(r=0.302,P＝0.004)有關(guān)。LC3低表達(dá)與腫瘤的大小(r=0.245,P=0.022)、較低的分化程度(r=0.504,P0.0001)和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(r=0.275,P=0.01)有關(guān)系。 5. Beclin1陰性表達(dá)病例組總體生存率顯著低于其陽(yáng)性表達(dá)病例組(P0.0001),LC3低表達(dá)組患者總體生存率相比于LC3高表達(dá)組顯著降低(P=0.0145)。單因素Cox回歸模型分析結(jié)果顯示腫瘤的臨床分期(P=0.0009)、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.0007)、腫瘤大小(P＝0.0038)以及Beclin1的表達(dá)(P0.0001)、LC3表達(dá)水平(P=0.018)均與總體生存率有關(guān)。采用多因素Cox回歸模型分析顯示自噬相關(guān)基因Beclin1的表達(dá)是影響HSCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 自噬相關(guān)基因Beclin1和LC3在HSCC中表達(dá)顯著降低,這種異常表達(dá)與HSCC腫瘤的臨床分期、分化程度以及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征有關(guān)。Beclin1陰性表達(dá)和LC3低表達(dá)與患者預(yù)后不良相關(guān),此外,Beclin1是影響HSCC患者總體生存率的獨(dú)立預(yù)后因素,這些結(jié)果提示自噬相關(guān)基因可能成為治療HSCC的新靶向分子。 第二部分敲掉Becl in1對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞系凋亡及增殖的影響 研究目的： 將Beclin1-siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)入人下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞系中,從而研究敲掉Beclin1對(duì)FaDu細(xì)胞系凋亡、增殖和轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)方法： 1.采用脂質(zhì)體法(lipofectamine2000)將Beclin1-siRNA轉(zhuǎn)染到人下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞系中,通過(guò)Real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)Beclin1-siRNA的轉(zhuǎn)染效率。采用Western blot方法檢測(cè)LC3-II蛋白水平在各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的表達(dá)情況。 2.應(yīng)用Annexin V-APC單染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)敲掉Beclin1對(duì)FaDu細(xì)胞凋亡的影響。 3.利用MTT方法檢測(cè)Beclin1-siRNA轉(zhuǎn)染FaDu細(xì)胞后,造成Beclin1低表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。 4.采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Beclin1-siRNA對(duì)FaDu細(xì)胞系轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.脂質(zhì)體法(lipofectamine2000)將Beclin1-siRNA轉(zhuǎn)染入人下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞系后,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率可達(dá)70%。 Real-time PCR和Western blot方法結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組相比,Beclin1-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Beclin1表達(dá)顯著降低(P0.05),即Beclin1-siRNA可以引起B(yǎng)eclin1在FaDu細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)。我們通過(guò)Western blot方法進(jìn)一步檢測(cè)LC3-Ⅱ在各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組相比,Beclin1-siRNA轉(zhuǎn)染組FaDu細(xì)胞中LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯降低(P0.003)。 2. Annexin V-APC單染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示Beclin1-siRNA轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別是17.11±0.46%和4.773±0.3%,通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,與陰性對(duì)照組相比,FaDu細(xì)胞系經(jīng)Beclin1-siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加(P=0.001)。 3.MTT方法結(jié)果表明與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比較,敲掉Beclin1后在96h內(nèi)FaDu細(xì)胞增殖未見(jiàn)明顯差異(P0.05),即Beclin1低表達(dá)對(duì)FaDu細(xì)胞增殖活性的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4. Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和Beclin1-siRNA轉(zhuǎn)染組中進(jìn)入小室的FaDu細(xì)胞轉(zhuǎn)移率分別是1.844±0.035、1.918±0.029和3.306±0.362,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02),即與對(duì)照組相比,Beclin1-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力明顯增強(qiáng)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 通過(guò)Beclin1-siRNA轉(zhuǎn)染人下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞系從而敲掉Beclin1,可抑制細(xì)胞自噬。與對(duì)照組相比,Beclin1(?)低表達(dá)可誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞凋亡,并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移侵襲能力,但對(duì)細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯影響。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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1 Fanny Daniel;Agnès Legrand;Dominique Pessayre;Nathalie Vadrot;Véronique Descatoire;Dominique Bernuau;;Partial Beclin 1 silencing aggravates doxorubicin-and Fasinduced apoptosis in HepG2 cells[J];World Journal of Gastroenterology;2006年18期

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本文編號(hào)：1595261