本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-34a在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的表達改變及其對人晶狀體上皮細胞凋亡作用的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《復旦大學》 2014年

MicroRNA-34a在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的表達改變及其對人晶狀體上皮細胞凋亡作用的機制研究

樊帆  

【摘要】：引言年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract, ARC)是全球致盲眼病的主要原因,手術(shù)仍是目前唯一的治療途徑,隨著當今社會老齡化的進展,白內(nèi)障手術(shù)需求量將逐年增加,給國民帶來了巨大的經(jīng)濟負擔。因此深入研究ARC的根本發(fā)病機制,以期找到早期有效的干預(yù)措施,具有重要意義。機體衰老是個復雜的過程,也是生命科學領(lǐng)域一直以來想要攻克的難題,其中包括晶狀體的老化,即白內(nèi)障形成,也是機體內(nèi)外各種環(huán)境、代謝因素參與致病的結(jié)果。已有研究證明表觀遺傳調(diào)控與環(huán)境危險因素和其他調(diào)節(jié)因素存在密切聯(lián)系,因此推測其在ARC復雜的發(fā)病機制中起著重要的作用。表觀遺傳學調(diào)控基因表達的機制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾及微小RNA (microRNA),是不涉及DNA序列改變的基因組修飾作用。其中microRNA是一組單鏈、內(nèi)源性的非編碼小RNA,通常與靶基因序列3'UTR特異性結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達,參與調(diào)節(jié)細胞的生長發(fā)育、分化、增殖、凋亡、應(yīng)激及衰老等生物學進程。往年]microRNA一直是腫瘤、血液中的研究熱點之一,而其在眼部疾病中的作用卻較少引起學者關(guān)注,近年來microRNA在眼科疾病中的研究也己初步展開。首次報道顯示microRNA的表達譜在人透明晶狀體上皮與白內(nèi)障晶狀體上皮中有顯著差異,這提示microRNA的異常表達在晶狀體發(fā)育、白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用�；谀壳暗难芯楷F(xiàn)狀,本文將著重研究microRNA參與ARC發(fā)病機制的具體分子機制,在體內(nèi)篩選、驗證microRNA在ARC中表達的改變,在體外探究microRNA誘導人晶狀體上皮細胞功能學改變的具體分子機制,并試圖探索在ARC中異常表達的microRNA啟動子DNA甲基化是否參與調(diào)控,是否共同相互作用參與ARC的發(fā)病機制。第一部分MicroRNA-34a在ARC的表達及其啟動子甲基化水平目的探討microRNA-34a (miR-34a)在年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)中的表達及其啟動子甲基化程度改變。方法收集ARC晶狀體前囊膜30例,透明晶狀體前囊膜18例,采用RT-PCR檢測miR-34a和miR-933的表達水平,并評價其表達在兩組間的差異：選擇在ARC組較對照組表達差異最顯著的miR-34a為研究對象,在12例ARC前囊膜及8例透明對照前囊膜組織進行焦磷酸鹽測序,檢測miR-34a啟動子區(qū)DNA甲基化程度。結(jié)果miR-34a在白內(nèi)障組表達高于透明晶狀體組(P0.05), miR-933的表達水平未見明顯差異(P=0.69)；其啟動子甲基化程度在兩組間無顯著差異(P=0.152)。結(jié)論miR-34a在ARC前囊膜表達升高,可能參與了ARC發(fā)病。第二部分MicroRNA-34a調(diào)控人晶狀體上皮細胞凋亡相關(guān)功能研究目的研究miR-34a對HLECs凋亡的影響。方法體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞系SRA01/04,將miR-34a雙鏈模擬物(miR-34a mimics)和陰性對照模擬物(negative mimics)分別轉(zhuǎn)染至人晶狀體上皮細胞系。轉(zhuǎn)染后24至72小時,流式細胞儀分析miR-34a轉(zhuǎn)染后細胞凋亡的改變,并檢測caspase3/7活性；Western Blot尋找上游激活靶蛋白；熒光顯微鏡觀察JC-1染色后線粒體內(nèi)膜電位改變,WB檢測細胞質(zhì)及線粒體細胞色素C(Cyto C)含量評價線粒體外膜功能；提取細胞總RNA,分析線粒體呼吸鏈上相關(guān)功能基因的表達；DCFH-DA探針法檢測細胞內(nèi)活性氧積聚程度。結(jié)果miR-34a mimics轉(zhuǎn)染48小時后SRA01/04發(fā)生早期及晚期凋亡的比例較對照組增加(P0.05),活化的caspase3/7表達升高(P0.05)。JC-1染色提示miR-34a過表達導致晶狀體上皮細胞線粒體內(nèi)膜電位下降,WB顯示Cyto C的含量在胞漿中顯著大于線粒體內(nèi),說明線粒體外膜通透性增加、功能受損：同時線粒體呼吸鏈上相關(guān)基因NDUFS8、COX5b和ATP5al表達明顯下降,提示線粒體呼吸鏈電子傳遞功能受損；DCFH探針熒光在miR-34a組顯著高于對照組,提示miR-34a過表達導致自由基產(chǎn)生,使胞內(nèi)活性氧基團(ROS)蓄積誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。結(jié)論晶狀體上皮細胞中miR-34a過表達可通過損傷線粒體功能而導致細胞凋亡。第三部分MicroRNA-34a調(diào)控人晶狀體上皮細胞凋亡的機制研究目的研究miR-34a在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控人晶狀體上皮細胞凋亡的具體機制。方法聯(lián)合利用生物信息學分析網(wǎng)站(Pictar、TargetScan、MiRanda)篩選miR-34a的候選靶基因,絕對定量PCR驗證晶狀體上皮細胞中候選靶基因的表達,在轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物與陰性對照模擬物的SRA01/04中利用相對定量PCR和WB檢測靶基因表達；構(gòu)建miR-34a與靶基因3'UTR互補結(jié)合的質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染至HEK293-T細胞,并用雙熒光素酶報告基因分析在轉(zhuǎn)錄水平進行靶基因驗證。確定靶基因后,轉(zhuǎn)染靶基因的si-RNA以實現(xiàn)靶基因敲減,再次利用流式細胞、caspase3/7活性與caspase9的WB評價細胞凋亡及線粒體功能的改變。結(jié)果篩選出靶基因Notch1、Notch2、Jag1、Jag2均位于Notch通路并在晶狀體上皮中表達,Notch1及Notch2是此通路中關(guān)鍵的受體蛋白基因,PCR及WB顯示在轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物的晶狀體上皮細胞中Notch1及Notch2的表達較對照組受到抑制；雙熒光素酶報告基因分析顯示Notch1和Notch2的3'UTR螢火蟲活性在miR-34a過表達組顯著抑制(P0.05),而突變型質(zhì)粒則對miR-34a過表達及陰性對照組間螢火蟲熒光活性無明顯改變(Notch1 mutant, P=0.720; Notch2 mutant, P=0.814),由此確定miR-34可直接與Notch1、Notch2的3'UTR結(jié)合抑制其表達。進而在晶狀體上皮細胞中將Notch1及Notch2基因敲減,進行流式凋亡功能檢測及caspase3/7活性檢測,發(fā)現(xiàn)Notch1敲減組細胞凋亡及caspase3/7活性增加不顯著(P=0.276),而Notch2敲減組細胞早期及晚期凋亡顯著增加(P0.05), caspase3/7活性也較對照組顯著升高(P0.05)。并且在Notch2敲減組的晶狀體上皮細胞中線粒體凋亡標志蛋白caspase9的表達顯著升高。結(jié)論miR-34a通過抑制靶基因Notch2表達誘導晶狀體上皮細胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R776.1
【目錄】：

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本文編號：158196