發(fā)布時間：2018-01-26 07:42

  本文關(guān)鍵詞： 視神經(jīng)損傷 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞 Nogo-A受體 Caspase-3　出處：《新疆醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 視神經(jīng)損傷是顱腦、面部和眼眶外傷嚴重的并發(fā)癥,受傷后視力損害嚴重,經(jīng)常遺留永久性視力障礙。長期以來,關(guān)于視神經(jīng)損傷的治療一直存在著爭議�，F(xiàn)有研究認為,使用糖皮質(zhì)激素為主的藥物治療法和手術(shù)治療法是最常用的治療手段,視神經(jīng)管減壓術(shù)已成為目前主要的手術(shù)治療方法,視神經(jīng)減壓術(shù)是解除直接壓迫,緩解神經(jīng)腫脹及血管痙攣,對于視神經(jīng)損傷有一定的療效；地塞米松對于視神經(jīng)損傷有著皮質(zhì)激素可通過其抗氧化作用減輕自由基對細胞膜結(jié)構(gòu)的損傷而使水腫減輕,同時阻斷外傷性炎癥介質(zhì)及血管活性物質(zhì)的產(chǎn)生,從而減輕血管痙攣,降低視神經(jīng)挫傷性壞死的嚴重性以及微循環(huán)血管痙攣程度的作用。以往實驗偏向于動物模型制作,對臨床指導(dǎo)作用缺乏。本實驗以視神經(jīng)減壓術(shù)、地塞米松藥物治療及視神經(jīng)減壓術(shù)聯(lián)合地塞米松藥物治療為影響因素,以視神經(jīng)Nogo受體,視網(wǎng)膜Nogo受體、Caspase-3為切入點,對兔視神經(jīng)損傷模型的視網(wǎng)膜及視神經(jīng)受體進行光鏡及電鏡下病理生理觀察。初步明確視神經(jīng)減壓術(shù)、地塞米松藥物治療及視神經(jīng)減壓術(shù)聯(lián)合地塞米松藥物治療對于視神經(jīng)模型的影響。為臨床視神經(jīng)治療提供理論基礎(chǔ)。通過假傷組與對照組驗證本實驗設(shè)計合理性。通過臨時動脈瘤夾閉視神經(jīng)制造可用于視神經(jīng)損傷手術(shù)或藥物治療的觀察研究穩(wěn)定的的動物模型。 方法： (1)實驗動物分組： 成年健康白兔96只,種屬為新西蘭白兔,體重2-2.5kg,由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后檢查雙側(cè)眼,發(fā)現(xiàn)屈光間質(zhì)清,瞳孔等大、等圓,對光反射靈敏,眼底無異常;其中6只為空白對照組,18只為假傷組,以排除手術(shù)因素對視神經(jīng)及視網(wǎng)膜的影響,對剩余72只白兔左眼進行視神經(jīng)損傷模型制作,隨機分為模型組、單純視神經(jīng)損傷組,地塞米松藥物治療影響組、視神經(jīng)減壓術(shù)影響組、視神經(jīng)減壓術(shù)聯(lián)合地塞米松藥物治療共同影響組四個大組,每個大組分為三個亞組,分別為術(shù)后1天組、7天組、21天組,每個亞組6只。 (2)動物模型的制作 3%戊巴比妥1ml/kg耳緣靜脈注射麻醉白兔后,俯臥位固定于手術(shù)臺；在雙目顯微鏡下,上瞼外側(cè)置一牽引縫線,固定以牽開上瞼；剪開球結(jié)膜,在上直肌及上斜肌肌止端處作牽引縫線；將眼球向眶前外下方向拉,顯微鏡下銳性分離球后軟組織,以暴露視神經(jīng),向深部分離視神經(jīng)約8mm,于球后3mm處用動脈瘤夾(蛇牌臨時動脈瘤夾FT250T,咬合長度9mm,最大開口7mm,閉合力0.88N,重量：9克。)夾閉20s(假傷組不夾閉視神經(jīng))。將眼球復(fù)位、縫合球結(jié)膜。生理鹽水沖洗眼眶,滴加左氧氟沙星滴眼液。動物模型建立標準：視神經(jīng)損傷動物模型建立術(shù)后,待蘇醒后放回籠內(nèi),檢查手術(shù)切口愈合良好,無化膿積膿,無滲血滲液,觀察傷眼瞳孔散大,直接對光反應(yīng)消失,術(shù)眼角膜透明、無外傷性白內(nèi)障發(fā)生、玻璃體腔無積血、視網(wǎng)膜血液供應(yīng)正常無出血和視網(wǎng)膜脫離發(fā)生、術(shù)眼玻璃體無炎性反應(yīng)、視網(wǎng)膜血管無出血及梗塞,無眼球突出及眼瞼閉合,不全者納入實驗。經(jīng)以上各項評價指標檢測反映該模型建立成功與否。經(jīng)上述標準檢查,96只新西蘭白兔的視神經(jīng)動物模型隨機分批納入實驗。動物飼養(yǎng)過程中,對于出現(xiàn)并發(fā)癥者排出實驗,并及時補足實驗動物數(shù)目。 (3)視神經(jīng)減壓術(shù) 按照實驗分組,對于需要實行視神經(jīng)減壓術(shù)的實驗動物,按上述模型制作方法制作模型,動脈瘤夾夾閉20s后,采用1ml注射器針頭顯微鏡下分離視神經(jīng)外包膜組織至球后視神經(jīng)8mm處,達到視神經(jīng)減壓目的。 (4)地塞米松給藥方法 所有地塞米松影響實驗動物,于術(shù)后當日開始,按每日每只1mg/kg劑量,進行肌肉注射,直至達到各處死節(jié)點。 (5)視神經(jīng)及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層標本采集及其形態(tài)學(xué)研究： 采用3%戊巴比妥鈉麻醉過量麻醉,開胸經(jīng)左心室插管至主動脈,上腔靜脈開口排出灌注液,依次灌注生理鹽水500ml,2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液250ml,至兔子出現(xiàn)四肢抽搐強直后,立即摘除眼球取視神經(jīng)視網(wǎng)膜標本置于固定液中,并標記,光鏡標本用4%多聚甲醛固定72h、脫水、石蠟包埋,通過視神經(jīng)乳頭,沿眼球的垂直經(jīng)線行前后方向視網(wǎng)膜全層進行切片,行HE染色。使用切片機制備切片。RGC計數(shù)方法：用光學(xué)顯微鏡(40物鏡)觀察,每個標本隨機抽取3張切片,距離視神經(jīng)乳頭上方和下方300um分別3個區(qū)域(每個區(qū)域25um*25um),統(tǒng)計存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目的總和。計算視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)總和然后取平均數(shù)并記錄實驗數(shù)據(jù),最后利用統(tǒng)計學(xué)軟件分析各組不同時間點視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)存活的細胞數(shù),其凋亡規(guī)律以及各組是否存在統(tǒng)計學(xué)差異。 電鏡標本：將視神經(jīng)標本用4%戊二醛電鏡固定液固定。冰箱恒溫保存,于電鏡室4%戊二醛和1%四氧化鋨雙重固定,丙酮梯度脫水,Epon812環(huán)氧樹脂包埋,LKB2188超薄切片機切片,鉛鈾電子染色,JEOL1230透射電子顯微鏡觀察。 (6)觀測指標及時間點 觀察指標：夾閉后1天、一周、3周觀察：1)夾閉后局部視網(wǎng)膜及視神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)光鏡觀察,及視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察；2)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell, RGC)計數(shù)(細胞原位凋亡技術(shù)檢測)；3)視網(wǎng)膜上Caspase-3的免疫組化檢測；4)視神經(jīng)、視網(wǎng)膜Nogo受體的免疫組化檢測,病理免疫組化結(jié)果進行相關(guān)性分析視神經(jīng)減壓術(shù)及地塞米松對于視神經(jīng)模型的影響。 (7)統(tǒng)計學(xué)分析：統(tǒng)計資料為多組定量資料,若分組或時間符合正態(tài)、方差齊性,進行方差分析,若不符合,使用Kruskal-wallis (KW)秩和檢驗。同時進行不同分組及不同時間的兩兩比較各組數(shù)據(jù)用sas jmp pro計算機統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組的計量資料以均數(shù)±標準差表示,以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表中*為不符合方差齊性,使用Wilcoxon秩和檢驗結(jié)果： (1)組織形態(tài)學(xué)光鏡觀察,采用HE染色法視神經(jīng)損傷后,光鏡下觀察,早期視網(wǎng)膜出現(xiàn)腫脹,各層厚度較正常略增厚,細胞排列疏松而紊亂,僅見視網(wǎng)膜毛細血管擴張,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞少量減少。 視網(wǎng)膜HE染色組織形態(tài)學(xué)觀察對照組視網(wǎng)膜層次清晰,R G C呈單層排列,整齊密集,胞核清楚,核膜光滑完整,各時間點損傷病理改變明顯,病變隨時間推移進行性加重。損傷一天組視網(wǎng)膜形態(tài)改變,細胞輕度水腫,厚度稍變厚,神經(jīng)節(jié)細胞層內(nèi)外層排列稍紊亂,細胞間隙增大,有少量核固縮,染色加深,大量節(jié)細胞空泡變性,細胞數(shù)量稍微減少。損傷一周組視網(wǎng)膜形態(tài)改變,較前一組加重,細胞水腫嚴重,神經(jīng)節(jié)細胞核染色質(zhì)深染加重,可見大量空泡變性的細胞,外層和內(nèi)層結(jié)構(gòu)紊亂,界限模糊不清,視網(wǎng)膜全層明顯變薄。損傷三周組,視網(wǎng)膜細胞水腫改變較之前有所減輕,核質(zhì)染色深染,各層結(jié)構(gòu)紊亂,視網(wǎng)膜全層變薄。 (2)視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察1天(圖3-1)神經(jīng)纖維輕微變形,髓鞘板層結(jié)構(gòu)輕度分離,局部可見泡狀結(jié)構(gòu),可見球狀突向軸漿,髓鞘板層結(jié)構(gòu)分離,軸漿神經(jīng)原纖維排列松散,以粗纖維為主,血管內(nèi)皮細胞腫脹,管腔不全阻塞,神經(jīng)纖維破碎,髓鞘塌陷等急性創(chuàng)傷改變排列不齊少量線粒體輕微腫脹。7天(圖3-2)髓鞘松解,髓鞘普遍變性,洋蔥樣小體形成,膠質(zhì)明顯增生,仍殘留有水腫軟化小區(qū)厚度增加,板層結(jié)構(gòu)分離層多層,個別表現(xiàn)為脫髓鞘。膠質(zhì)細胞輕微腫脹,線粒體空泡變,部分神經(jīng)軸漿空泡變。21天(圖3-3)神經(jīng)變性,神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)不規(guī)則,髓鞘結(jié)構(gòu)紊亂明顯,可見鞘膜泡狀解離,部分纖維軸漿空泡變,水腫軟化灶消失,由膠質(zhì)代替.各治療組無明顯差別。 (3)視神經(jīng)細胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞在急性視神經(jīng)損傷模型建立后視神經(jīng)減壓術(shù)治療在(1d)有差異(P0.05),且有統(tǒng)計學(xué)意義。地塞米松、視神經(jīng)管減壓術(shù),兩者有差異(P0.05)具有統(tǒng)計學(xué)意義。視神經(jīng)減壓術(shù)、地塞米松及減壓地塞米松三種治療組與單純損傷組在7天、21天個時間點均無差異(P0.05),且無統(tǒng)計學(xué)意義。 (4)視網(wǎng)膜上Caspase-3的免疫組化的檢測 視神經(jīng)減壓術(shù)、地塞米松及減壓地塞米松三種治療與單純損傷組在1天時間點有差異(P0.05),且具統(tǒng)計學(xué)意義。與單純損傷組在7天、21天個時間點均無差異(P0.05),且無統(tǒng)計學(xué)意義。 (5)視神經(jīng)視網(wǎng)膜Nogo受體的免疫組化檢測 Nogo-A在正常成年大鼠視神經(jīng)和視網(wǎng)膜中廣泛分布。急性視神經(jīng)損傷可以促使Nogo-A表達上調(diào)。視神經(jīng)減壓術(shù)、地塞米松及減壓地塞米松三種治療與單純損傷組在1天時間點有差異(P0.05),且具統(tǒng)計學(xué)意義。與單純損傷組在7天、21天個時間點均無差異(P0.05),且無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： (1)本研究通過臨時動脈瘤夾閉視神經(jīng),可制造穩(wěn)定的、可重復(fù),易操作的用于視神經(jīng)損傷手術(shù)或藥物治療觀察研究的動物模型,通過假傷組視神經(jīng)及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞及特殊分子生物學(xué)表達的統(tǒng)計學(xué)分析,假傷組與對照組驗證本實驗設(shè)計合理,可較好的運用視神經(jīng)損傷實驗動物造模；據(jù)細胞數(shù)目變化時間點得出視神經(jīng)細胞凋亡時間可能遲于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡時間。 (2)本研究結(jié)果顯示：急性視神經(jīng)損傷后RGC凋亡是一個隨時間進行而發(fā)生的持續(xù)細胞凋亡過程。本實驗視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)表中單純減壓組細胞數(shù)低于單純夾閉組,可能因視神經(jīng)為大腦中樞神經(jīng)的延續(xù),與周圍神經(jīng)有本質(zhì)的區(qū)別,神經(jīng)鞘膜切開可能對視神經(jīng)造成新的損傷；提示對于臨床上外傷患者及時減壓神經(jīng)鞘外(骨性管、血腫)壓迫結(jié)構(gòu),可能是較好的治療手段。是否能通過測定不同程度損傷后視神經(jīng)鞘內(nèi)組織壓,觀察病理微環(huán)境改變來證實此假說。 (3)急性視神經(jīng)損傷可以促使Caspase-3陽性表達上調(diào),表明Caspase-3可能在視神經(jīng)損傷的神經(jīng)再生過程中發(fā)揮著重要作用。Nogo-A在正常成年大鼠視神經(jīng)和視網(wǎng)膜中廣泛分布,急性視神經(jīng)損傷可以促使Nogo-A表達上調(diào),表明Nogo-A可能在視神經(jīng)損傷的神經(jīng)再生過程中發(fā)揮著重要作用。視神經(jīng)免疫組化表達早于細胞形態(tài)變化表達,如何運用新的手段通過臨床上超早期運用Caspase-3、Nogo-A抑制劑或其他治療手段對阻止細胞凋亡死亡具有重要意義,下調(diào)Caspase-3陽性表達、Nogo-A陽性表達的手段可能就是臨床療效良好的手段。 (4)在急性視神經(jīng)損傷模型建立后視神經(jīng)減壓術(shù)治療、地塞米松及減壓地塞米松治療可能在早期(1d)防止急性視神經(jīng)損傷后RGC細胞凋亡,對急性視神經(jīng)損傷后視神經(jīng)及視網(wǎng)膜21天作用無明顯差異,P0.05,且無統(tǒng)計學(xué)意義,三種治療對急性視神經(jīng)損傷后RGC細胞保護作用不確定。地塞米松的治療應(yīng)在一周,一周以上可能無效或可能產(chǎn)生相反作用機制。視神經(jīng)特殊生理解剖特性,在一定損傷后病理潰變在目前治療手段下具有不可逆轉(zhuǎn)的趨勢。原發(fā)視神經(jīng)損傷程度決定預(yù)后。 (5)本研究結(jié)果顯示：三種治療方法不能有效減少視神經(jīng)損傷后視神經(jīng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡數(shù)目,但其確切機制需要進一步的研究。這一實驗結(jié)果尚需進一步的分析。但三者最終結(jié)果差異小,可能目前臨床治療手段不佳,手術(shù)減壓需盡早去除鞘外壓迫組織,治療方向需要調(diào)整,仍需大量多方向多角度進一步研究。目前視神經(jīng)損傷治療應(yīng)朝抗細胞凋亡方向發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R774.6

【參考文獻】

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本文編號：1465082