本文關(guān)鍵詞： 喉鱗狀細(xì)胞癌 RhoC ALDH1A1 腫瘤干細(xì)胞 轉(zhuǎn)移　出處：《中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 通過外源基因?qū)爰夹g(shù)抑制和增強喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞-Hep2中RhoC(Ras homology C,Ras同源類似物C)表達(dá)，觀察腫瘤細(xì)胞凋亡、運動、形態(tài)學(xué)變化及腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1A1（Aldehydedehydrogenase1family, member A1乙醛脫氫酶1A1）表達(dá)的變化，研究RhoC對喉鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為及腫瘤起始細(xì)胞群-腫瘤干細(xì)胞的影響，為以RhoC為治療靶點控制喉鱗癌的轉(zhuǎn)移提供實驗支持。 方法： （1）通過分子生物學(xué)方法設(shè)計合成干擾RhoC表達(dá)可轉(zhuǎn)錄形成RhoC-shRNA（RhoC-short hairpin ribonucleic acid,RhoC短發(fā)卡核糖核酸）從而抑制RhoC表達(dá)的RhoC-shRNA基因重組質(zhì)粒GW-shRNA （RhoC-shRNA基因真核表達(dá)質(zhì)粒載體為pENTR/U6-EGFP）和增強RhoC表達(dá)的RhoC G14V基因重組質(zhì)粒13GS03（RhoC G14V基因真核表達(dá)質(zhì)粒載體為pcDNA3.1-EGFP）。（2）運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系-Hep2細(xì)胞中，并通過轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化，獲得最佳細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。（3） QPCR(Real-time Quantitativepolymerasechainreaction Detecting System,實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng))技術(shù)檢測影響RhoC表達(dá)后Hep2腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物-ALDH1A1的mRNA(messenger ribonucleic acid,信使RNA)表達(dá)。（4）TUNEL法檢測影響RhoC表達(dá)后Hep2細(xì)胞凋亡情況的變化。（5）熒光染色細(xì)胞骨架觀察影響RhoC表達(dá)后，Hep2細(xì)胞的形態(tài)變化。（6）劃痕實驗觀察影響RhoC表達(dá)后Hep2細(xì)胞的的運動能力的變化。 結(jié)果： （1）通過將兩種重組質(zhì)粒進行基因測序及采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T腎上皮細(xì)胞系，證實干擾RhoC表達(dá)的重組質(zhì)粒-GW-shRNA和增強RhoC表達(dá)的重組質(zhì)粒-13GS03構(gòu)建成功。 （2）24孔板培養(yǎng)條件下，抑制RhoC表達(dá)的重組質(zhì)粒GW-shRNA和增強RhoC表達(dá)的重組質(zhì)粒13GS03與脂質(zhì)體以1.2μｇ質(zhì)粒與4.2μl脂質(zhì)體混合形成的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，Hep2喉鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染率最高。 （3）抑制Hep2細(xì)胞RhoC表達(dá)后：腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1A1表達(dá)顯著降低；凋亡增強；細(xì)胞形態(tài)改變明顯，胞體較大，形狀近似多邊形。 （4）增強Hep2細(xì)胞RhoC表達(dá)后：腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1A1及腫瘤細(xì)胞凋亡較未處理Hep2細(xì)胞變化不顯著；細(xì)胞形態(tài)變化明顯，細(xì)胞近似梭形，類似間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，提示細(xì)胞運動能力增強。 （5）劃痕實驗檢測細(xì)胞運動能力結(jié)果顯示抑制RhoC表達(dá)使喉鱗癌Hep2腫瘤細(xì)胞運動能力減低；增強RhoC表達(dá)后Hep2腫瘤細(xì)胞運動能力增強。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建抑制RhoC表達(dá)重組質(zhì)粒GW-shRNA和增強RhoC表達(dá)重組質(zhì)粒13GS03，為后續(xù)研究RhoC在喉鱗癌Hep2細(xì)胞中的功能奠定了實驗基礎(chǔ)。 2、通過QPCR技術(shù)檢測增強RhoC表達(dá)后喉鱗狀細(xì)胞癌Hep2腫瘤細(xì)胞群中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1A1與空白對照組相比無顯著變化，但抑制RhoC表達(dá)后ALDH1A1顯著降低，間接說明了RhoC參與喉鱗癌腫瘤干細(xì)胞的形成，，在轉(zhuǎn)移灶起始發(fā)生中具有一定的作用。 3、通過改變Hep2細(xì)胞中RhoC表達(dá)，觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示增強RhoC表達(dá)后細(xì)胞腫瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象不明顯，與對照組相比無明顯變化，抑制RhoC表達(dá)腫瘤細(xì)胞凋亡增強，說明RhoC具有抑制喉鱗癌腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，提高了腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移擴散中對周圍陌生環(huán)境的適應(yīng)能力，使具有活性的腫瘤細(xì)胞能夠順利到達(dá)轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生部位。 4、通過改變RhoC表達(dá)觀察Hep2細(xì)胞形態(tài)及運動能力的變化，結(jié)果顯示，增強RhoC表達(dá)后喉鱗癌腫瘤細(xì)胞運動能力增強，抑制RhoC表達(dá)后腫瘤細(xì)胞運動能力減弱，說明RhoC對喉鱗癌腫瘤細(xì)胞擴散轉(zhuǎn)移具有促進作用。 由此可見，RhoC在喉鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移灶形成中發(fā)揮著重要作用，以RhoC為治療靶點具有重要的臨床應(yīng)用價值。
[Abstract]:Objective:
Through the technique of introducing foreign gene inhibition and enhancement of RhoC laryngeal squamous cell carcinoma cell line -Hep2 (Ras homology C Ras homolog C) expression, observe the apoptosis of tumor cells, movement, and the morphological changes of tumor stem cell marker ALDH1A1 (Aldehydedehydrogenase1family member, A1 1A1 expression of aldehyde dehydrogenase), RhoC on the biological behavior of larynx squamous cell carcinoma and tumor initiating cells tumor stem cells, RhoC to provide experimental support for the transfer of control target in the treatment of laryngeal squamous cell carcinoma.
Method錛

本文編號：1458573