本文關鍵詞： 感音神經(jīng)性聾 生物治療 納米載體 乳酸聚乙醇酸-聚乙二醇 內耳遞送　出處：《中國人民解放軍醫(yī)學院》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：多種原因如強噪聲暴露或者耳毒性藥物應用等都能夠引起耳蝸內組織結構或者細胞的受損。一般情況下，這種損害過程都開始于耳蝸毛細胞（包括外毛細胞和內毛細胞），隨后引起Corti’s器結構的破壞，最終導致聽覺損傷。耳聾相關研究認為，聽覺損傷最終得以治療，最根本的方法還是通過外源生物干預治療使耳蝸毛細胞再生，或者在耳蝸毛細胞損傷的特定病理時期進行相關干預，最終使之得到修復。 在各種研究開發(fā)的耳聾治療方案中，生物治療是最具有應用潛力的。同時，內耳結構內部流動的液體以及相對狹小獨立的空間等特點又使得耳蝸可以作為理想的生物治療體系加以研究應用�？茖W家們經(jīng)過對不同類型耳聾發(fā)病機制和聽覺神經(jīng)細胞發(fā)育的研究和探索，先后發(fā)現(xiàn)了一系列針對聽功能起保護或修復作用的核酸、多肽和小分子化合物等，這些生物分子可以通過對內耳感覺細胞的修復或再生，實現(xiàn)聽功能不同程度的保護或恢復。 選擇合適的遞送載體將目的高效、安全地導入內耳組織和細胞中，是耳聾生物治療的關鍵。常用的載體分為兩大類：病毒載體及非病毒載體。上世紀九十年代，研究人員首次使用病毒載體將外源基因導入內耳，開創(chuàng)了內耳細胞保護或再生研究中載體技術開發(fā)應用的先河。然而，，病毒性載體的缺陷，以及以往報道的致死性個案病例，又讓人們開始重新審視應用病毒性載體的安全問題。近年來，對于載體的選擇及應用研究，逐漸轉向了非病毒性載體，其中，納米載體應用又成為生物醫(yī)學領域的發(fā)展熱點。研究證實，納米載體能夠在生物治療過程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的表達特性，具備較高的安全性及細胞特異性等優(yōu)點，為傳統(tǒng)的耳病防治和干預研究提供了全新的策略。 聚乳酸-羥基乙酸(poly(D,L-lactide-co-gly-colide)，PLGA)是最具代表性的一類納米類載體系統(tǒng)，為丙交酯和乙交酯的共聚物，具有良好的生物相容性 及生物可降解性。經(jīng)PEG修飾的PLGA納米載體復合物結構可控，在生理pH值條件下，通過PLGA疏水性核心包載多種多肽、蛋白質類藥物，并且依靠該復合物表面的PEG與帶有負電荷的細胞膜結合并相互作用，保證了多肽、蛋白質類藥物在無明顯降解的情況下，通過包吞作用進入細胞內，發(fā)揮治療疾病的作用。 本實驗第一部分通過對PLGA的表面修飾，成功獲得具有緩釋功能的PLGA-PEG納米顆粒遞送載體，并且通過雙乳法包載BSA蛋白，成功制備mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs，且包載率達到51.2%。第二部分應用已經(jīng)合成mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs體外轉導Hela細胞系，用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞內FITC熒光情況，評估m(xù)PEG-PLGA-BSA-FITC-NPs體外進入細胞的效率，同時用MTT法檢測mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs納米遞送系統(tǒng)對于Hela細胞的毒性并計算細胞存活率。同時，我們首次通過手術手段，應用mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs經(jīng)完整圓窗膜滲透途徑導入活體豚鼠內耳中，用共聚焦顯微鏡觀察并評估m(xù)PEG-PLGA-BSA-FITC-NPs在內耳的有效率，驗證并突出強調mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs作為一種新型納米載體在內耳毛細胞再生中的應用潛力。在實驗的第三部分，我們開創(chuàng)性的應用脈沖式火花噪聲儀對正常小型豬進行噪聲暴露，通過對強噪聲暴露后的小型豬模型進行聽功能評估及耳蝸病理形態(tài)學研究，首次成功建立了基于大型哺乳動物的噪聲性聾小型豬動物模型，為此后內耳導入研究奠定基礎。最后，我們嘗試應用mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs進行噪聲性聾小型豬動物模型內耳導入研究，以期為mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs納米載體的內耳應用提供重要的臨床前研究數(shù)據(jù)。 本研究創(chuàng)新點： 1．用PEG修飾PLGA納米顆粒，并成功通過雙乳法包載BSA蛋白，最終獲的大小約為232±2.6nm、具有良好分散性和緩釋特性的納米顆粒蛋白遞送體系； 2.成功將mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs體外導入細胞系，并獲得較高安全性和有效性。同時，首次實現(xiàn)mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs在體豚鼠內耳遞送，并呈現(xiàn)明顯的時間依賴性。 3.首次成功建立小型豬噪聲性聾動物模型，分析噪聲性聾小型豬聽功能及內耳形態(tài)特點，填補了大型哺乳動物噪聲性聾動物模型的空白。 4.首次嘗試應用mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs納米顆粒進行小型豬噪聲性聾動物模型的內耳導入研究，為未來大型哺乳動物聽功能干預研究提供了重要的研究基礎。
[Abstract]:Various causes , such as strong noise exposure or ototoxic drug use , can cause damage to tissue structures or cells in the cochlea . In general , such damage processes begin with cochlear hair cells ( including outer hair cells and inner hair cells ) , which subsequently cause damage to the Corti ' s device structure and eventually lead to hearing impairment . In the treatment of deafness in various research and development , biotherapy is the most promising . At the same time , the fluid inside the inner ear structure and the relatively narrow and independent space can be used as the ideal biological treatment system . The scientists have discovered a series of nucleic acids , polypeptides and small molecule compounds which have been used to protect or repair different types of deafness , and these biomolecules can protect or restore the hearing function to different degrees by repairing or regenerating the sensory cells of the inner ear . In recent years , researchers have gradually shifted to non - viral vectors by introducing foreign genes into the inner ear using viral vectors . Poly ( D , L - lactide - co - gly - colide ) , poly ( D , L - lactide - co - gly - colide ) ( PLGA ) , is the most representative type of nano - carrier system , which is a copolymer of lactide and glycolide and has good biocompatibility . and the PEG - modified PLGA nano - carrier composite structure is controllable , and under the condition of physiological pH value , a plurality of polypeptides and a protein drug are loaded through a PLGA hydrophobic core , and the PEG on the surface of the compound is combined with the cell membrane with a negative charge and interacts so as to ensure the polypeptide and the protein drug to enter the cell through the endocytosis , so as to play the role of treating diseases . In the first part of the experiment , PLGA - PEG nano - particle delivery vehicle with sustained - release function was successfully obtained by surface modification of PLGA , and the cell survival rate was 51.2 % . Innovation point of this study : 1 . The PLGA nanoparticles were modified with PEG and the BSA protein was successfully prepared by double emulsion method . The final product was 232 鹵 2.6 nm , which had good dispersibility and sustained release properties . 2 . The mPEG - PLGA - BSA - FITC - TiO2 was successfully introduced into the cell line in vitro , and high safety and efficacy were obtained . At the same time , the mPEG - PLGA - BSA - FITC - induced drug was first delivered in the inner ear of the guinea pig and showed a significant time - dependence . 3 . The animal model of small pig noise was successfully established for the first time , and the characteristics of hearing function and inner ear morphology were analyzed in order to fill the blank of animal model of noise - induced deafness in large mammals . 4 . In order to provide an important research foundation for the study of auditory function intervention in large mammals in the future , the introduction of mPEG - PLGA - BSA - FITC - TiO2 nanoparticles was first attempted .

【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R764.43

【共引文獻】

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本文編號：1451303