本文關(guān)鍵詞：Plk1在鼻咽癌和喉癌中的靶向治療價(jià)值研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：Plk1(Polo-like kinase 1)是一個(gè)從酵母到人類高度保守的真核生物絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員。大量研究已經(jīng)證明,其主要參與細(xì)胞有絲分裂過程的調(diào)節(jié)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并被公認(rèn)是一個(gè)有良好應(yīng)用前景的惡性腫瘤治療新靶點(diǎn)。然而,關(guān)于Plk1與在鼻咽癌和喉癌中的作用及其靶位治療價(jià)值,國內(nèi)外仍鮮有報(bào)道。本論文主要采用RNA干擾技術(shù)首次對(duì)此進(jìn)行相對(duì)系統(tǒng)的研究,結(jié)果分述匯總?cè)缦? (1)高效Plk1 siRNA序列的快速篩選:首先設(shè)計(jì)并合成了四組新的候選Plk1 siRNA序列,然后主要采用人喉癌Hep2細(xì)胞系和常用腫瘤細(xì)胞系HeLa,結(jié)合細(xì)胞表型檢測和基因表達(dá)水平分析,對(duì)這些候選siRNA序列進(jìn)行了篩選。細(xì)胞生長分裂表型觀察結(jié)果表明,這四組Plk1 siRNA均能夠有效抑制Hep2和HeLa細(xì)胞的生長分裂。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)染后72 h,與對(duì)照組相比,各Plk1 siRNA轉(zhuǎn)染組均出現(xiàn)明顯的有絲分裂期阻滯效應(yīng),大量細(xì)胞被阻滯于M期。同時(shí),與對(duì)照組相比,在各Plk1 siRNA轉(zhuǎn)染組中,位于sub-G1期的細(xì)胞比例顯著升高,強(qiáng)烈提示Plk1 siRNA誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡。RT-PCR分析結(jié)果表明,各組Plk1 siRNA均能有效抑制Plk1在mRNA水平上的表達(dá)。Western印跡分析結(jié)果表明,各組Plk1 siRNA均能有效抑制Plk1在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)。綜合上述結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn):Plk1-siRNA-607、Plk1-siRNA-838和Plk1-siRNA-484這三組序列的效果更強(qiáng),不僅能顯著抑制內(nèi)源性Plk1的表達(dá),而且也具有很強(qiáng)抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘發(fā)大規(guī)模細(xì)胞凋亡的作用,可用于后續(xù)的以Plk1為靶點(diǎn)的抗腫瘤基因治療藥物研發(fā)。另外,我們也嘗試了逆向篩選思路,即首先直接檢測不同Plk1 siRNA候選序列對(duì)細(xì)胞生長表型的影響,最后再確證Plk1 siRNA對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性Plk1表達(dá)的抑制效應(yīng)。結(jié)果表明,這種篩選策略和傳統(tǒng)的篩選策略相比,具有簡易、快速和高效的特點(diǎn),也非常適用于對(duì)Plk1 siRNA和小分子抑制劑的大規(guī)模篩選。 (2)Plk1 siRNA-607對(duì)鼻咽癌和喉癌細(xì)胞生長增殖的影響:本部分研究則在前一部分研究的基礎(chǔ)上,使用篩選出的高效Plk1-siRNA-607序列,在轉(zhuǎn)染后分別設(shè)置了24h和48h兩個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn),相對(duì)系統(tǒng)地研究其對(duì)人喉癌細(xì)胞系Hep2和人鼻咽癌細(xì)胞系HNE1生長、細(xì)胞周期和凋亡的影響,由此初步評(píng)價(jià)以Plk1為靶點(diǎn)開展頭頸癌治療的可行性和潛在應(yīng)用價(jià)值。細(xì)胞生長分析結(jié)果表明:Plk1 siRNA-607能夠通過有效的抑制Plk1表達(dá)而抑制人喉癌細(xì)胞系Hep2和人鼻咽癌細(xì)胞系HNE1的生長增殖和誘發(fā)細(xì)胞凋亡,且以在Hep2的生長增殖抑制效應(yīng)要明顯強(qiáng)于HNE1。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明, Plk1 siRNA-607轉(zhuǎn)染組的Hep2和HNE1細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的有絲分裂期阻滯效應(yīng),大量細(xì)胞被阻滯于有絲分裂期,磷酸化Histone H3表達(dá)水平均顯著提高;且位于sub-G1期的細(xì)胞比例顯著升高。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡分析結(jié)果表明,Plk1 siRNA-607轉(zhuǎn)染組的Hep2和HNE1細(xì)胞均出現(xiàn)大量FITC+/PI 凋亡細(xì)胞,表明Plk1 siRNA-607可誘發(fā)Hep2和HNE1細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。這些研究結(jié)果表明,siRNA介導(dǎo)的Plk1表達(dá)沉默是一種有效的鼻咽癌和喉癌治療策略,提示Plk1可做為一個(gè)新的分子靶點(diǎn)用于鼻咽癌和喉癌的治療。 (3)siRNA介導(dǎo)的Plk1表達(dá)沉默對(duì)COS7細(xì)胞生長增殖的影響:在本部分研究中,我們觀察了siRNA介導(dǎo)的Plk1表達(dá)沉默對(duì)體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞系COS-7細(xì)胞生長增殖的影響,主要目的在于探討Plk1作為分子靶點(diǎn)用于腫瘤治療的普遍性。結(jié)果表明,Plk1表達(dá)被抑制后,細(xì)胞生長顯著受到抑制,大致大規(guī)模的細(xì)胞凋亡,大量細(xì)胞進(jìn)入sub-G1期。該結(jié)果和前述第一部分和第二部分中使用HeLa、Hep2和HNE1等腫瘤細(xì)胞系獲得的研究結(jié)果類似,說明Plk1可作為分子靶點(diǎn)用于多種腫瘤的治療。 綜上,本論文對(duì)于Plk1在鼻咽癌和喉癌中的作用及其靶向治療價(jià)值進(jìn)行了相對(duì)系統(tǒng)的初步研究,為進(jìn)一步研究和開發(fā)以Plk1為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療藥物尤其是鼻咽癌和喉癌的抗腫瘤治療藥物奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),具有積極的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
[Abstract]:Plk1 ( Polo - like kinase 1 ) is a member of a eukaryotic serine / threonine protein kinase family that is highly conserved from yeast to human . A large number of studies have shown that it is mainly involved in the regulation of mitosis and the development of tumor , and is recognized as a promising new target for malignant tumors . However , there are few reports on the role of Plk1 in nasopharyngeal carcinoma and laryngeal carcinoma and its target therapeutic value . The results showed that Plk1 siRNA - 607 , Plk1 - siRNA - 838 and Plk1 - siRNA - 484 could effectively inhibit the expression of Plk1 on protein level . and is also very suitable for large - scale screening of Plk1 siRNA and small molecule inhibitor .

(2)Plk1 siRNA-607瀵歸薊鍜界檶鍜屽枆鐧岀粏鑳?yōu)鐢熼暱澧瀸D栫殑褰卞搷:鏈儴鍒嗙爺絀跺垯鍦ㄥ墠涓，

本文編號(hào)：1434551