本文關鍵詞：鹽酸椒苯酮胺對慶大霉素致豚鼠耳蝸毛細胞及螺旋神經節(jié)細胞損傷的保護作用研究

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【摘要】：研究背景 聽力障礙是耳鼻喉科常見疾病,據2013年世界衛(wèi)生組織報道,全世界有3.6億人遭受殘疾性聽力損失困擾,占全球人口的5.3%,其中三分之二在發(fā)展中國家。中國是世界上最大的發(fā)展中國家,聽力障礙殘疾人有2057萬,占全國人口的16.79‰,為各類殘疾之首,其嚴重影響公眾身體健康和生活質量。因此,能否找到有效的方法預防和治療聽力損傷是我們目前面臨的巨大挑戰(zhàn)。 聽力障礙包括傳導性耳聾、感音神經性耳聾及混合性耳聾,絕大部分患者為感音神經性聾。目前認為其發(fā)病原因有,缺血、藥物耳毒性、遺傳、老年性、噪聲性、病毒感染、自身免疫疾病、聽神經病、中樞疾病、腫瘤等。感音神經性聾是內耳及其神經傳導通路一系列病變所致聽力損失的總稱,病理改變主要是毛細胞、螺旋神經節(jié)、突觸復合體、耳蝸神經及聽中樞等器質性改變。 內耳包含兩種類型的感受器細胞：內毛細胞(inner hair cell,IHC)和外毛細胞(outer hair cell,OHC),可將機械能轉換為生物電能(細胞感受器電位),螺旋神經節(jié)細胞是傳入神經元,將感受器電位激發(fā)形成的神經動作電位傳入中樞,形成聽覺或位置覺。內、外毛細胞與螺旋神經節(jié)的I型、II型傳入神經元樹突分別形成傳入突觸。內毛細胞可將不同頻率、強度的聲音信號轉換為電信號,形成電勢能,刺激突觸前膜釋放神經遞質到相應的螺旋神經元,再由螺旋神經元投射到中樞神經系統(tǒng),形成聽覺。外毛細胞對聲音信號具有放大作用,使耳蝸對聲音頻率有高度的敏感性和選擇性,以輔助內毛細胞。耳蝸內毛細胞傳入突觸的數量、形態(tài)、結構和功能異常會導致感音神經性聾。因此,在聲音信號的傳遞過程中,毛細胞、螺旋神經節(jié)等傳入神經通路的任何部位損傷都將引起感音神經性聾。耳蝸是高耗能組織,在缺血缺氧時可引起毛細胞壞死、傳入神經腫脹導致聽力障礙；噪聲也可傷害耳蝸毛細胞及傳入神經；動物實驗中發(fā)現,氨基糖苷類抗生素可以導致外毛細胞纖毛損害,甚至外毛細胞本身的損害和死亡,并且也有研究表示其可直接或間接導致螺旋神節(jié)細胞凋亡壞死。缺血再灌注、噪聲、藥物中毒都是感音神經性聾的常見原因,但是有研究指出缺血5min后傳入神經腫脹,再灌注后傳入神經損傷逐漸恢復至正常；而AmAn的耳毒性呈持續(xù)性,即使停藥也不能阻止聽力損害,更利于我們觀察一些預防和治療措施對耳蝸損傷所起的作用。本實驗通過常見的氨基糖苷類抗生素(Aminoglycoside antibiotics,AmAn)--慶大霉素(Gentamicin,GM),建立耳毒性藥物致感音神經性聾的動物模型。 AmAn耳毒性發(fā)生率高,并且此損傷是不可逆的,在兒童、老人及免疫力低下者中其耳毒性發(fā)生率更高。毒性作用使AmAn在臨床應用中受到一定程度限制,但是AmAn在治療嚴重感染如敗血癥、泌尿道感染、革蘭陰性菌引起的腹內感染,與β-內酰胺類聯(lián)合治療心內膜炎等仍有特殊價值；耳科用其鼓室內注射治療梅尼埃��；目前有研究表明AmAn可抑制HIV復制的活性,這使得AmAn的很多應用不可替代。慶大霉素是由小單飽菌發(fā)酵產生的一種殺菌力較強的廣譜抗生素,臨床應用較廣泛,由于其肝腎毒性較其他AmAn,所以是制造感音神經性聾動物模型的理想藥物。 慶大霉素進入內耳后主要集中于內耳淋巴液,其產生毒性的靶細胞是毛細胞和螺旋神經節(jié)細胞。目前認為GM損傷耳蝸結構主要圍繞線粒體損傷,細胞凋亡,氧自由基及鈣超載。GM損傷線粒體是通過阻斷70S核糖體循環(huán)導致蛋白合成障礙,破壞線粒體膜功能,造成線粒體能量供應障礙；線粒體損傷使膜轉換電子能力降低,形成大量氧自由基,誘發(fā)耳蝸毛細胞內產生大量細胞內活性氧產物(reactive oxygen species,ROS)。氧自由基和鈣超載除直接造成細胞損傷外還可以導致細胞的凋亡。有研究指出,細胞凋亡是氨基糖苷類抗生素致聾的主要方式,可通過多條途徑實現,但大部分最終都依賴于Caspase-3的活化,Caspase-3是細胞凋亡的執(zhí)行者。GM在內耳淋巴液中半衰期較長,可被耳蝸毛細胞攝取入胞內,通過上述機制導致細胞凋亡壞死。毛細胞可與螺旋神經節(jié)樹突構成突觸連接,是傳入神經的“營養(yǎng)供給站”,其釋放神經營養(yǎng)因子和神經遞質(谷氨酸等),使神經末梢保持活力,毛細胞被破壞,傳入神經及螺旋神經節(jié)細胞缺乏營養(yǎng)而發(fā)生延遲性死亡。 目前認為在哺乳動物中,毛細胞損傷后再生困難,通過毛細胞再生及耳蝸干細胞移植治療感音神經性耳聾的方法仍在探索中。傳入神經系統(tǒng)損傷是導致感音神經性聾的一個重要病理改變,傳入神經系統(tǒng)包括突觸復合體、神經末梢及螺旋神經節(jié)細胞等,突觸結構很容易受外界環(huán)境影響導致其功能的異常,螺旋神經節(jié)細胞受損后也難以修復。雖有實驗表明,傳入神經損傷后神經纖維可再生并和毛細胞形成聯(lián)系；且螺旋神經節(jié)細胞死亡后周圍的施萬細胞增殖,但其不能分化成正常功能的神經元細胞來發(fā)揮作用。目前臨床上可通過佩戴助聽器和人工耳蝸移植來輔助感音神經性聾患者獲得部分聽力,但是由于習慣勢力及經濟原因導致其不能廣泛使用,大部分患者仍依賴藥物治療。因此,對藥物治療感應神經性聾的探索是耳科研究的重點和難點。 鹽酸椒苯酮胺(peperphentonamine hydrochloride, PPTA),是我國自主創(chuàng)新研發(fā)的鈣增敏劑類強心藥及心肌保護劑,已獲得3個發(fā)明專利,11類化學藥品臨床試驗批件,且已經完成了127例Ⅰ期臨床試驗。臨床前研究表明其不僅具有保護受損心肌、增強心功能并能降低心肌耗氧量的雙重作用；還可通過增加SOD活性及GSH含量,減少NO含量,發(fā)揮神經保護作用,并且可降低缺血腦組織Caspase-3mRNA的表達,表現出良好的抗凋亡作用。與心腦組織損傷類似,鈣超載、自由基、細胞凋亡也是耳蝸損傷的常見原因,PPTA對心腦的保護機制為本研究提供了方向。 本研究第一部分分別建立豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷模型及慶大霉素致豚鼠耳毒性動物模型,通過聽性腦干反應(ABR)、聽毛細胞內琥珀酸脫氫酶的變化,掃描電鏡觀察兩種模型內耳結構的改變,在實驗過程中發(fā)現慶大霉素致豚鼠耳蝸損傷的動物模型更適合于觀察耳蝸損傷；第二部分我們通過建立慶大霉素致豚鼠耳蝸損傷模型以觀察PPTA對耳蝸毛細胞及螺旋神經節(jié)細胞的保護作用,通過聽性腦干反應(ABR)、毛細胞內琥珀酸脫氫酶染色、脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記技術(ternial-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeing,TUNEL)、蛋白質免疫印跡技術(Western blot)、透射電鏡等方法檢測ABR閾值、Caspase-3蛋白表達、聽毛細胞內線粒體功能狀態(tài)、螺旋神經節(jié)細胞凋亡指數及內耳細胞凋亡和壞死等形態(tài)學變化,探討GM的耳毒性機理及PPTA對耳蝸損傷的保護機制,為感音神經性聾藥物治療提供新的實驗依據。 本研究分為以下兩個部分 第一部分豚鼠耳蝸損傷模型的建立 目的 選擇合適的耳蝸損傷模型以便下一步觀察PPTA對耳蝸損傷的保護作用。方法 1.1實驗動物及分組：健康純白赤目豚鼠36只,隨機分為3組,8只用于實驗,4只備用：空白對照組(control group,A組)、缺血再灌注組(I/R group,B組)、慶大霉素組(GM group,C組)。 1.2實驗動物模型的建立：A組不做任何處理；B組2%戊巴比妥鈉麻醉后,頸前正中逐層切開皮膚及皮下組織,分離出雙側椎動脈和右側頸總動脈,無創(chuàng)微動脈夾夾住血管,1h后松開再灌注；C組肌肉注射慶大霉素,120mg/kg/d,7d. 1.3實驗方法及指標觀察：聽性腦干反應(auditory brainstem response, ABR)分析造模前及造模后1、7d各組豚鼠聽力變化；ABR測量結束后,迅速處死豚鼠,斷頭取右側聽泡,暴露耳蝸蝸軸,運用基底膜平鋪技術,Nachlas氏四唑藍法顯示聽毛細胞內琥珀酸脫氫酶(Succinatedehydrogenase, SDH)活性、并輔以掃描電鏡觀察形態(tài)學改變。 結果 1、ABR反應閾：A組各時間點無明顯差異(P=0.104,0.05)；B、C組造模后1d、7d與造模前有顯著差異(P0.05)；B組在造模7d后有所好轉,C組聽力呈持續(xù)性下降。2、形態(tài)學變化：A組聽毛細胞琥珀酸脫氫酶著色均勻、無缺失,細胞形態(tài)正常。B組：毛細胞排列稍紊亂,著色較均勻；透射電鏡下可見外毛細胞纖毛倒伏、缺失,細胞間有裂隙,形態(tài)辨別不清。C組部分聽毛細胞琥珀酸脫氫酶未著色,電鏡下見細胞死亡、形態(tài)破壞嚴重。 結論 缺血再灌注組再灌注后一段時間內聽力有所恢復,而慶大霉素對毛細胞呈持續(xù)性損害作用,因此慶大霉素致豚鼠耳蝸損傷模型適合于進一步觀察PPTA對耳蝸損傷的保護作用。 第二部分鹽酸椒苯酮胺對慶大霉素致豚鼠耳蝸毛細胞及螺旋神經節(jié)細胞損傷的保護作用研究 目的 研究鹽酸椒苯酮胺對慶大霉素致耳蝸毛細胞和螺旋神經節(jié)細胞損傷的保護作用。 方法 1.1實驗動物及分組：健康純白赤目豚鼠36只,隨機分3組,每組12只：空白對照組(control group)、慶大霉素組(GM group)和鹽酸椒苯酮胺組(PPTA group)。 1.2各實驗組藥物應用：GM組用慶大霉素100mg/kg/d,肌肉注射,14d; PPTA組用慶大霉素致聾并靜脈注射PPTA,10mg/kg/d,14d;空白對照組用等量生理鹽水肌肉注射。 1.3實驗方法及指標觀察：聽性腦干反應(auditory brainstem response,ABR)分析實驗前及實驗14d天后聽力閾值及Ⅰ波潛伏期變化。實驗結束后,迅速斷頭取雙側聽泡,左側耳蝸用Western blot檢測組織中Caspase-3蛋白表達；右側6只耳蝸用TUNEL染色觀察耳蝸細胞凋亡情況,并計算細胞凋亡指數；剩余右側耳蝸分別觀察毛細胞琥珀酸脫氫酶染色及透射電鏡觀察形態(tài)學改變。 結果 1、ABR反應閾：實驗結束,正常組、GM組、PPTA組閾值分別為14.58±1.16dB、65.95±1.17dB、36.13±1.17dB,各組間聽力閾值變化率有顯著差異(P0.05)；Ⅰ波PL分別為1.094±0.028、1.667±0.028、1.254±0.028；各組間聽力閾值變化率有顯著差異(P0.05)；。2、凋亡指數：螺旋神經節(jié)細胞凋亡細胞率分別為0.02±0.00、0.45±0.03、0.16±0.02,各組間有顯著差異(P0.05)；3、耳蝸Caspase-3蛋白表達：各組Caspase-3表達分別為1.09±0.11、2.55±0.20、1.67±0.07,各組間有顯著差異(P0.05)；4、毛細胞琥珀酸脫氫酶染色：對照組毛細胞著色深,均勻；GM組14d后毛細胞大量死亡；PPTA組部分外毛細胞著色淺,整體顏色淺。TUNEL染色及透射電鏡觀察：GM組螺旋神經節(jié)存在大量凋亡細胞形態(tài),核固縮；神經纖維脫髓鞘改變,PPTA組以上損傷情況較GM組減輕。 結論 PPTA對慶大霉素豚鼠耳蝸毛細胞和螺旋神經節(jié)細胞損傷起到保護作用。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R764.4

【參考文獻】

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本文編號：1139585