發(fā)布時(shí)間：2017-10-30 01:24

  本文關(guān)鍵詞：MicroRNA調(diào)控上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制及其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響

  更多相關(guān)文章： 鼻咽癌 耐藥 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 microRNA siRNA 侵襲 遷移

【摘要】：目的： 1.研究鼻咽癌耐藥細(xì)胞株的相關(guān)特性、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)表型，初步探討EMT與鼻咽癌耐藥、轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 2.研究鼻咽癌耐藥細(xì)胞中microRNAs（miRNAs）的變化，并進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA。 3.探討miRNA調(diào)控EMT的機(jī)制及其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響。 方法： 1. MTT法探討不同濃度的順鉑(DDP)作用于鼻咽癌細(xì)胞HNE1，HNE1/DDP24、48、72h后對(duì)細(xì)胞存活率的影響，以明確其劑量-效應(yīng)關(guān)系和耐藥指數(shù)；細(xì)胞生長(zhǎng)情況采用不同時(shí)間（24、48、72、96、120、144、168h）計(jì)算鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的細(xì)胞數(shù)目；利用Western blot檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP中MRP、Mcl-1、Bcl-2、Bax、Puma的蛋白表達(dá)水平；利用熒光定量RT-PCR檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP中MDR1、MRP、Bcl-2、Bax的mRNA變化。 2.采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的遷移能力；利用transwell小室作細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)與重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP在體外遷移與侵襲能力；倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征；利用Western blot檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞HNE1，HNE1/DDP中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、β-catenin、 Vimentin、Fibronectin、MMP-9及轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1的表達(dá)；利用熒光定量RT-PCR檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞HNE1，HNE1/DDP中EMT相關(guān)標(biāo)志E-cadherin、β-catenin、 Vimentin、Fibronectin、MMP-9及轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1的mRNA變化。 3. MicroRNA（miRNA）芯片技術(shù)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP中miRNAs表達(dá)變化，并進(jìn)一步篩選差異表達(dá)的miRNA；熒光定量RT-PCR驗(yàn)證其差異表達(dá)的miRNA；利用Western blot和熒光定量RT-PCR檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP中HIF-1α的表達(dá)水平。 4.將miRNA的模擬物（mimics）和抑制劑（inhibitors）轉(zhuǎn)染進(jìn)入鼻咽癌細(xì)胞中，熒光定量RT-PCR檢測(cè)miRNA的變化，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化，Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移能力變化，利用Western blot和熒光定量RT-PCR檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志E-cadherin、Vimentin、MMP-9的變化，倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征。 5.預(yù)測(cè)miRNA的潛在靶基因，利用Western blot和熒光定量RT-PCR檢測(cè)調(diào)控miRNA對(duì)靶基因的影響；轉(zhuǎn)染小干擾RNA，熒光定量RT-PCR檢測(cè)mRNA的變化，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化，Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移能力變化，倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征，Western blot和熒光定量RT-PCR檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志E-cadherin、Vimentin、MMP-9的變化。 結(jié)果： 1.鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP對(duì)DDP具有耐藥的特性 (1) MTT法顯示：不同濃度的DDP (2、4、8、16、32μmol·L-1)在24、48、72h抑制鼻咽癌細(xì)胞HNE1、HNE1/DDP的增殖，且隨著DDP濃度的增加抑制作用增強(qiáng)。鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP、HNE1在24、48、72h的半數(shù)抑制率(IC50)分別是29.04±2.82、19.44±1.77、11.39±1.89μmol·L-1和6.84±1.59、4.25±0.36、2.35±0.96μmol·L-1及其耐藥指數(shù)(RI)分別為4.25、4.57、4.85，HNE1/DDP細(xì)胞相對(duì)于HNE1細(xì)胞對(duì)DDP不敏感，且在正常培養(yǎng)條件下，HNE1/DDP細(xì)胞相對(duì)于HNE1細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。 (2) Western blot結(jié)果顯示：HNE1/DDP細(xì)胞與HNE1細(xì)胞相比，MRP、Mcl-1、Bcl-2表達(dá)升高，但Bax、Puma表達(dá)下降。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示：在HNE1/DDP細(xì)胞中， MDR1、MRP、Bcl-2表達(dá)上調(diào)和Bax表達(dá)下調(diào)。 2. HNE1/DDP細(xì)胞增加侵襲和遷移的潛能，并誘發(fā)EMT (1)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HNE1/DDP細(xì)胞與HNE1細(xì)胞相比具有較強(qiáng)的遷移能力。Transwell小室法結(jié)果顯示，HNE1/DDP細(xì)胞相對(duì)于HNE1細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)。 (2)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征，HNE1細(xì)胞是細(xì)胞與細(xì)胞連接、集落生長(zhǎng)、圓形、沒(méi)有偽足形成，類(lèi)似于上皮樣；相對(duì)而言，HNE1/DDP細(xì)胞是細(xì)胞與基質(zhì)連接、狹長(zhǎng)、分散性生長(zhǎng)、有偽足形成，類(lèi)似于間質(zhì)樣。 (3) Western blot和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，HNE1/DDP細(xì)胞中上皮標(biāo)志分子（如E-cadherin、β-catenin）的表達(dá)明顯低于HNE1細(xì)胞，而HNE1/DDP細(xì)胞中間質(zhì)標(biāo)志分子（如Vimentin、Fibronectin、MMP-9）的表達(dá)明顯高于HNE1細(xì)胞。此外，，HNE1/DDP細(xì)胞中EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1的表達(dá)明顯高于HNE1細(xì)胞。 3.鼻咽癌細(xì)胞中miRNA的表達(dá) MiRNA芯片結(jié)果顯示，HNE1/DDP細(xì)胞與HNE1細(xì)胞相比有18種miRNAs表達(dá)上調(diào)和9種miRNAs表達(dá)下調(diào)。在這些miRNAs中，miR-10b是最具有差異表達(dá)的miRNA。在HNE1/DDP細(xì)胞與HNE1細(xì)胞相比中，熒光定量RT-PCR驗(yàn)證miR-10b具有25倍上調(diào)。同時(shí)，Western blot和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，HNE1/DDP細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)明顯高于HNE1細(xì)胞。 4. MiR-10b調(diào)控EMT及其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響 (1)表達(dá)miR-10b的HNE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-10b的模擬物，高表達(dá)miR-10b的HNE1/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-10b抑制劑。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，miR-10b模擬物能升高miR-10b的表達(dá)，而miR-10b抑制劑能抑制miR-10b的表達(dá)。 (2)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-10b模擬物能明顯增強(qiáng)HNE1細(xì)胞遷移能力，miR-10b抑制劑降低HNE1/DDP細(xì)胞遷移能力。此外，Transwell小室法結(jié)果顯示，miR-10b模擬物能明顯增加HNE1細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)，miR-10b抑制劑減少HNE1/DDP細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)。 (3) Western blot和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，miR-10b模擬物能使HNE1細(xì)胞中E-cadherin減少和Vimentin、MMP-9增加，miR-10b抑制劑能使HNE1/DDP細(xì)胞中E-cadherin增加和Vimentin、MMP-9減少。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征，miR-10b模擬物能使HNE1細(xì)胞中出現(xiàn)更多的間質(zhì)樣細(xì)胞，miR-10b抑制劑能使HNE1/DDP細(xì)胞從間質(zhì)樣梭形細(xì)胞轉(zhuǎn)化為上皮樣細(xì)胞。 5. MiR-10b通過(guò)介導(dǎo)KLF4和Notch1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞EMT的調(diào)控作用 (1)采用miRTarBase軟件預(yù)測(cè)miR-10b的靶基因，其中KLF4和Notch1選作進(jìn)一步研究。Western blot和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，HNE1/DDP細(xì)胞中KLF4的表達(dá)明顯低于HNE1細(xì)胞，但Notch1的表達(dá)高于HNE1細(xì)胞。 (2) Western blot結(jié)果顯示，miR-10b模擬物能使HNE1細(xì)胞中KLF4減少，miR-10b抑制劑能使HNE1/DDP細(xì)胞中KLF4增加。但熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，miR-10b的過(guò)表達(dá)或抑制對(duì)KLF4沒(méi)有影響。Western blot和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，miR-10b模擬物能使HNE1細(xì)胞中Notch1增加，而miR-10b抑制劑能使HNE1/DDP細(xì)胞中Notch1減少。 (3)將鼻咽癌細(xì)胞HNE1/DDP轉(zhuǎn)染Notch1siRNA和對(duì)照siRNA，培養(yǎng)48h后，western blot和qRT-PCR檢測(cè)Notch1表達(dá)減少。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Notch1siRNA能明顯減少HNE1/DDP細(xì)胞的遷移能力。此外，Transwell小室法結(jié)果顯示，Notch1siRNA能明顯減少HNE1/DDP細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)。 (4)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征，Notch1siRNA能使HNE1/DDP細(xì)胞從間質(zhì)樣梭形細(xì)胞轉(zhuǎn)化為上皮樣細(xì)胞。Western blot和熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，Notch1siRNA能使HNE1/DDP細(xì)胞中E-cadherin增加和Vimentin、MMP-9減少。 結(jié)論： 1.順鉑耐藥鼻咽癌細(xì)胞具有耐藥的特性，進(jìn)而誘發(fā)EMT變化且增加侵襲和遷移的潛能。 2.多個(gè)miRNA在鼻咽癌細(xì)胞中差異表達(dá)，可能在順鉑耐藥和EMT中起重要作用。 3.過(guò)表達(dá)的miR-10b能促進(jìn)HNE1細(xì)胞的侵襲和遷移，并且伴隨著EMT的發(fā)生。相反，抑制miR-10b的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)EMT。此外，miR-10b在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控KLF4的表達(dá)，其在鼻咽癌細(xì)胞中可能通過(guò)KLF4調(diào)控EMT。 4. Notch1與miR-10b的變化水平相一致；Notch1基因敲除降低HNE1/DDP細(xì)胞的遷移和侵襲，并逆轉(zhuǎn)EMT。在鼻咽癌細(xì)胞中，調(diào)控miR-10b減少Notch1的表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)EMT。
【關(guān)鍵詞】：鼻咽癌 耐藥 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 microRNA siRNA 侵襲 遷移
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-14
• 前言14-17
• 材料與方法17-32
• 1. 材料與儀器17-18
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法18-31
• 3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理31-32
• 結(jié)果32-49
• 1. 鼻咽癌細(xì)胞 HNE1/DDP 對(duì) DDP 具有耐藥的特性32-34
• 2. 鼻咽癌 HNE1/DDP 細(xì)胞增加侵襲和遷移的潛能,并誘發(fā) EMT34-37
• 3. 鼻咽癌細(xì)胞中 miRNA 的表達(dá)37-39
• 4. MiR-10b 調(diào)控 EMT 及其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響39-44
• 5. MiR-10b 通過(guò)介導(dǎo) KLF4 和 Notch1 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞 EMT 的調(diào)控作用44-49
• 討論49-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 致謝57-58
• 附錄A 英中文術(shù)語(yǔ)縮略語(yǔ)表58-59
• 附錄B 常用試劑配制方法59-62
• 附錄C 個(gè)人簡(jiǎn)歷及發(fā)表論文62-63
• 附錄D 綜述63-72
• 參考文獻(xiàn)69-72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 Samantha F.Kornfeld;Kyle K.Biggar;Kenneth B.Storey;;Differential Expression of Mature MicroRNAs Involved in Muscle Maintenance of Hibernating Little Brown Bats, Myotis lucifugus: A Model of Muscle Atrophy Resistance[J];Genomics, Proteomics & Bioinformatics;2012年05期

2 Xiang-Ming Ding;;MicroRNAs: regulators of cancer metastasis and epithelialmesenchymal transition(EMT)[J];Chinese Journal of Cancer;2014年03期

本文編號(hào)：1115507