本文關鍵詞：順鉑在喉癌腫瘤細胞轉化為干細胞樣腫瘤細胞中的機制研究

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【摘要】：喉癌是喉部最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率目前有明顯增長趨勢,占全身惡性腫瘤的5.7%一7.6%[1],發(fā)病機理目前仍存在許多假說,一般認為與吸煙、飲酒、空氣污染、病毒感染和性激素及受體有關。雖然近年隨著微創(chuàng)手術、放療、化療、同步放化療及生物治療等綜合性治療措施改進以及共同應用,已使患者的生存時間及生活質量有所提高，但喉癌的復發(fā)、轉移及對放化療不敏感常使治療效果欠佳。越來越多的研究表明，這可能與腫瘤干細胞有關。 腫瘤干細胞（Cancer stem cells,CSCs）學說認為:腫瘤組織中存在極少量充當干細胞角色的腫瘤細胞,它們具有自我更新和多向分化潛能,在腫瘤的形成和生長中起著重要作用,是腫瘤生長、轉移和復發(fā)的根源。側群細胞（sidepopulation，SP）分析法作為腫瘤干細胞分離鑒定的一種方法，主要是利用干細胞能夠將熒光染料H oechst33342外排的特性,經(jīng)過紫外激發(fā)后用雙波長(450nm和675nm以上波長)監(jiān)測,可以觀察到這群細胞發(fā)出微弱的藍色和紅色熒光,在流式二維分析點陣圖上,呈彗星狀分布在陽性染色的主群(main population,MP或者non-SP)細胞的一側[1,2]。 第一部分喉癌側群細胞分選的條件優(yōu)化 【目的】探討喉癌細胞株Hep-2中側群細胞（side population，SP）分選的優(yōu)化條件。 【方法】取對數(shù)生長期的Hep-2細胞，予胰酶消化后，用含2%胎牛血清1640培養(yǎng)基制成1×106個/ml單細胞懸液。①實驗組喉癌細胞懸液中加入Hoechst33342至終濃度分別為5μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml，于37℃中孵育90min。②取單細胞懸液，分別于37°水浴中孵育Hoechst50、70、90、110、130min。③實驗組喉癌細胞懸液加入Hoechst后，分別孵育于37°水浴及37°恒溫箱中。兩組保持Hoechst濃度及細胞密度一致。④取匯合度分別為100%、70%的兩瓶細胞，同上制成單細胞懸液。分別加入相同濃度的Hoechst，并于37°水浴。染色結束于冰上終止染色5min后，離心，去上清，加入PBS重懸細胞，且均于上機前5min加入碘化丙啶（PI）至1μg/ml，后上流式細胞儀進行檢測鑒定。以上各組均設陰性組于Hoechst染色前加維拉帕米，至終濃度為150μmol/ml，，并于37℃中孵育30min后，其他各條件保持與相應實驗組一致。 【結果】①當Hoechst33342濃度分別為5μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml時，SP%分別為（39.96±0.240）%、（26.23±0.385）%、（18.79±0.023）%、（19.01±0.138）%，死細胞比例分別為（30.45±0.634)%、(49.9±0.42)%、(50.12±0.68)%、(64.16±0.387)%。②Hoechst在37°水浴中孵育90min時，流式細胞圖形最典型，SP%為(17.37±1.423）%；③孵育于37°水浴較孵育恒溫箱中，實驗組未被Hoechst33342標記的細胞分別為（18.67±0.448）%、（22.6±0.497）%；④匯合度90%以上較匯合度70%的細胞，SP%由（19.075±0.464)%降到（16.073±0.519)%。以上結果均經(jīng)SPSS16.0分析，p0.05，差別有統(tǒng)計學意義。 【結論】在流式細胞儀分選喉癌Hep-2側群細胞中Hoechst33342的最佳濃度為10μg/ml，最佳孵育時間為90min，且水浴優(yōu)于恒溫箱中孵育，細胞密度最好選擇80-90%之間。 第二部分喉癌側群細胞的分選及其體外生物學特性 【目的】探討喉癌細胞株Hep-2中干細胞樣側群細胞（side population,SP）的分選方法及側群細胞的干細胞特性。 【方法】制備喉癌Hep-2單細胞懸液，經(jīng)Hoechst33342染色后，用熒光激活細胞分選技術分選出人喉癌側群和非側群(non-SP,NSP)細胞，測定SP細胞亞群所占的比例。電子顯微鏡下觀察SP及NSP細胞形態(tài)，檢測兩群細胞的細胞周期、CCK8檢測細胞的增殖能力。熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測SP及NSP細胞中的ABCG2mRNA的相對量，結果用2-Δ(ΔCt)計算。 【結果】流式細胞儀分析結果表明，SP細胞在Hep-2細胞株中占(13.17±1.85)％.生長曲線（CCK8法）示，SP細胞較NSP細胞有更強的增殖能力；兩者所處的細胞周期相似，S期細胞比例及增殖指數(shù)(proliferation index，PI）兩者相比，t分別為0．678、0．614(p0.05)。RT-PCR示SP中ABCG2mRNA含量高于NSP。 【結論】人Hep-2細胞株中存在一部分能將Hoechst33342排出的側群細胞。SP細胞較NSP有更強的體外增殖能力，具有干細胞活性。SP細胞中ABCG2mRNA表達量明顯高于NSP細胞。 第三部分順鉑在喉癌非側群細胞轉化為干細胞樣腫瘤細胞中作用的探討 【目的】探討喉癌細胞株Hep2經(jīng)流式分選后的非側群細胞經(jīng)化療藥物誘導轉變?yōu)楦杉毎麡幽[瘤細胞的可能機制。 【方法】喉癌Hep2細胞株經(jīng)流式細胞儀熒光活化細胞分選系統(tǒng)（fluorescence-actived cell sortin,FACS）分選后，獲得的非側群待貼壁80%后分別加入順鉑（實驗組）和生理鹽水(對照組)培養(yǎng)48h，再次上流式細胞儀檢測兩組側群細胞比例;并通過熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）及western blot分別在mRNA和蛋白水平檢測兩組細胞的干細胞樣標記β-catenin、notch-1的基因和蛋白的表達情況。 【結果】實驗組非側群細胞經(jīng)順鉑（終濃度1ug/ml）作用48h后，側群細胞比例為(17.16±0.18)%，對照組則為(10.05±1.20)%，兩者差異有統(tǒng)計學意義（t=5.844，P=0.004）。熒光定量RT-PCR示經(jīng)順鉑處理實驗組的β-catenin、notch-1mRNA較對照組顯著增多；western blot示實驗組細胞中β-catenin、notch-1蛋白表達量較對照組顯著增加(t=5.155，P=0.031；t=5.977，P=0.004）。 【結論】非側群細胞經(jīng)化療藥物順鉑誘導后可分化為干細胞樣腫瘤細胞。其可能機制是通過wnt/β-catenin、notch轉導通路異常誘導非側群細胞轉化為干細胞樣腫瘤細胞。
【關鍵詞】：喉癌 側群細胞 腫瘤干細胞 流式細胞術 順鉑 β-catenin notch-1
【學位授予單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.65
【目錄】：

• 目錄3-4
• 英文縮寫4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 第一部分 喉癌細胞株 Hep-2 中側群細胞分選條件優(yōu)化材料方法16-30
• 材料方法16-20
• 結果20-25
• 討論25-26
• 參考文獻26-30
• 第二部分 喉癌中側群細胞的分選及其體外生物學特性材料方法30-43
• 材料方法30-34
• 結果34-39
• 討論39-41
• 參考文獻41-43
• 第三部分 順鉑在喉癌非側群細胞轉化為干細胞樣腫瘤細胞中作用的探討材料方法43-57
• 材料方法43-47
• 結果47-49
• 討論49-53
• 參考文獻53-57
• 綜述 側群細胞與喉癌腫瘤干細胞57-67
• 參考文獻63-67
• 發(fā)表論文67
• 碩士在讀期間參加的學術會議67
• 碩士在讀期間參與研究的課題67-68
• 致謝68-69

【參考文獻】

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉巖;喉癌側群細胞生物學特性的研究[D];吉林大學;2011年

本文編號：1095708