本文關鍵詞：Atoh1過表達調控哺乳動物耳蝸毛細胞再生的體外研究

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【摘要】：目的：Atohl/Math 1基因誘導耳蝸原位及異位毛細胞再生已經得到體內及體外實驗證實,抑制Notch信號通路可以誘導新生鼠及胚胎額外毛細胞再生,但Notch信號通路與Atohl共同作用于新霉素處理后的感覺上皮誘導毛細胞再生的效果尚無研究。Atohl表達水平決定內外毛細胞發(fā)育、成熟,但是否同樣決定異位毛細胞樣細胞發(fā)育成熟未得到證實。且異位新生毛細胞樣細胞是否會類似發(fā)育中的內外毛細胞發(fā)生匯聚伸展現(xiàn)象,又與哪些調控因素有關未見文獻報道。因此,本研究擬解決如下問題：1) Atohl過表達及Notch通路抑制劑DAPT單獨或聯(lián)合作用新霉素處理后的大鼠基底膜,觀察原位區(qū)域毛細胞樣細胞是否具有差異；2)不同滴度的Ad5-EGFP-Atohl作用于體外培養(yǎng)的基底膜,觀察小上皮脊異位毛細胞樣細胞的數(shù)目變化及纖毛發(fā)育、成熟。3) Ad5-EGFP-Atohl誘導產生的異位毛細胞樣細胞是否具有匯聚伸展現(xiàn)象及其影響因素。方法：本研究以體外培養(yǎng)耳蝸基底膜誘導毛細胞再生為模型。1)取耳蝸中圈基底膜體外培養(yǎng),新霉素處理后,不同濃度胎牛血清共培養(yǎng),然后行Ad5-EGFP-Atohl/Ad5-EGFP轉染, 取耳蝸感覺上皮高效轉染的基底膜進行Notch信號通路阻滯劑培養(yǎng),轉染8天后沿耳蝸感覺上皮區(qū)域長軸方向計數(shù)200um范圍內Myosin7a陽性細胞數(shù)目。并利用激光共聚焦和T檢驗從形態(tài)學和統(tǒng)計學角度驗證和分析抑制Notch信號通路對Atoh1誘導的原位區(qū)域毛細胞再生的調控作用。2)分別使用0.16×108,0.4×108,0.8×108,1.6×108,2.4×108 PFU/mlAd5-EGFP-Atoh1轉染培養(yǎng)的中圈基底膜,對病毒轉染后不同時間點的標本進行固定和免疫組織化學染色,計數(shù)不同滴度的病毒組不同時間點小上皮脊非感覺上皮異位新生毛細胞樣細胞的數(shù)目,并觀察異位新生毛細胞樣細胞形態(tài)變化及纖毛變化。3)觀察不同病毒組不同時間點小上皮脊最外側異位新生毛細胞樣細胞至感覺區(qū)域的距離變化及異位新生毛細胞樣細胞之間的間距變化,評估異位異位新生毛細胞樣細胞是否具有群體匯聚伸展現(xiàn)象,并分析相關調控因素。結果：1)、①新霉素處理的基底膜經10%血清培養(yǎng)48h后,支持細胞間距明顯變大,感覺上皮Atohl轉染效率增加。②Atoh1過表達于耳蝸感覺上皮后感覺區(qū)域新生毛細胞樣細胞生成。③Notch通路抑制劑DAPT與Atohl共同作用于耳蝸感覺上皮,原位區(qū)域毛細胞樣細胞數(shù)目明顯增多。EGFP對照組、DAPT、DMSO單獨作用于耳蝸感覺上皮無新生毛細胞樣細胞生成。 2)、①梯度為0.16×108,0.4x10* , 0.8xlO8 , 1.6x10* PFU/ml的腺病毒轉染基底膜24小時后,小上皮脊區(qū)域轉染效率隨濃度上升逐漸增加。2.4xlO8 PFU/ml組基底膜組織破壞、細胞離斷。? 0.16xl08 PFU/ml組在不同的時間點均未觀察到異位毛細胞樣細胞。0.4x10*, 0.8x10*, 1.6x10* PFU/ml組小上皮脊區(qū)域異位新生毛細胞樣細胞數(shù)目隨病毒滴度增加而增加,隨Atohl作用時間增加而增加。③Atohl表達水平高的非感覺細胞短時間內快速變?yōu)楫愇恍律毎麡蛹毎?表達水平低的細胞逐漸變?yōu)楫愇恍律毎麡蛹毎?Atohl表達水平過低的細胞無法轉變?yōu)槊毎麡蛹毎?部分未能成功轉變?yōu)楫愇恍律毎麡蛹毎姆歉杏X細胞部分逐漸轉變?yōu)楦杏X前體細胞。?O.lxiO8 -1.6x10* PFU/ml濃度范圍內, 異位新生毛細胞樣細胞纖毛形態(tài)隨Atohl表達水平增加、作用時間延長而逐漸發(fā)育、成熟,形態(tài)近似于V字型。3X (DAtohl誘導的異位新生毛細胞樣細胞可自發(fā)發(fā)生群體匯聚遷移運動,最外側細胞逐漸、緩慢向Corti's區(qū)域遷移運動,最終與內外毛細胞融合為一體,對照組小上皮脊細胞未觀察到動態(tài)改變。? 0.4x10*-1.6x10* PFU/ml濃度范圍內,異位新生毛細胞樣細胞群體匯聚遷移速度隨Atohl表達水平及作用時間增加而增加。③異位新生毛細胞樣細胞表面細胞粘附蛋白E-cadherin表達水平高,對照組的表達低。結論： 1)、①新霉素與血清共同作用提高感覺上皮腺病毒轉染效率。(2) Atohl過表達誘導感覺上皮區(qū)域新生毛細胞樣細胞再生。Notch通路抑制劑促進Atohl誘導的耳蝸感覺上皮區(qū)域毛細胞再生作用。2)、①病毒轉染滴度不同,小上皮脊非感覺細胞轉染效率不同。(DAtohl過表達水平越高,作用時間越長,異位新生毛細胞樣細胞數(shù)目越多、纖毛形態(tài)越成熟。3)、異位新生毛細胞樣細胞具有群體自發(fā)性匯聚遷移現(xiàn)象,且與Atohl表達量及作用時間有關。
【關鍵詞】：Atoh1/Math1 Atoh1表達水平 轉染效率 毛細胞樣細胞(HCLCs) 異位毛細胞樣細胞(EHCLCs) 纖毛 Notch信號通路抑制劑 DAPT 匯聚伸展(CE) 鈣粘附蛋白(E-cadherin) 小上皮脊(LER) 體外培養(yǎng)
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R764.43
【目錄】：

• 縮寫詞表4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 第—部分：抑制Notch信號通路促進Atoh1誘導的耳蝸毛細胞再生的體外研究11-25
• 前言11
• 材料11-12
• 實驗方法12-15
• 附圖與結果15-22
• 結果22
• 討論22-24
• 結論24-25
• 第二部分：Atoh1表達水平及作用時間調控耳蝸異位毛細胞再生25-42
• 前言25
• 材料25-26
• 實驗方法26-28
• 附圖與結果28-39
• 結果39
• 討論39-41
• 結論41-42
• 第三部分：Atoh1誘導的異位再生毛細胞群體匯聚遷移現(xiàn)象及相關影響因素42-54
• 前言42
• 材料42-43
• 實驗方法43-44
• 附圖與結果44-50
• 結果50
• 討論50-53
• 結論53-54
• 參考文獻54-57
• 全文小結57-58
• 綜述58-65
• 參考文獻61-65
• 承擔科研項目65-66
• 發(fā)表文章66-67
• 致謝67-69

【共引文獻】

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 萬勇;成骨細胞分泌的Wnt蛋白對于骨質重塑和骨髓間充質干細胞的維持的調控[D];上海交通大學;2013年

2 叢寧;Math1誘導體外聽覺感覺上皮再生[D];復旦大學;2011年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 晉鳳珍;功能蛋白的0-糖基化參與調控卵巢癌細胞的遷移以及E-鈣粘蛋白的表達[D];重慶醫(yī)科大學;2013年

2 戴尉君;Math-1/NGF-b基因共轉染治療噪聲性聽力損傷的基礎研究[D];第二軍醫(yī)大學;2013年

3 張平平;低糖基化E-cadherins抑制舌癌細胞增殖和侵襲的機理研究[D];山東大學;2014年

4 李中凡;P120-catenin和VE-cadherin在顱內動脈瘤壁的表達及意義[D];南昌大學;2014年

5 馬銳;抑制FGF信號通路對橢圓囊毛細胞再生的調控研究[D];復旦大學;2013年

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本文編號：1089926