本文關(guān)鍵詞：塞來昔布-PLGA緩釋微球抑制實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管的研究

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【摘要】：目的:脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）是由多種病因所致的脈絡(luò)膜血管芽穿過Bruch膜并在視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）下和/或上增殖形成的纖維血管膜，是老年人群重要的致盲原因之一。研究證明炎癥因素是脈絡(luò)膜新生血管重要的發(fā)病機(jī)制之一。以往實(shí)驗(yàn)中已證明高選擇性的COX-2抑制劑塞來昔布通過全身給藥抑制BN大鼠(采用激光誘導(dǎo)CNV的動(dòng)物模型)CNV的形成。由于這些給藥方式，，或是難以使藥物進(jìn)入眼組織，或是操作繁瑣效率低下，或是藥物濃度不能平穩(wěn)的作用于病灶，本實(shí)驗(yàn)制備一種新的藥物劑型塞來昔布-PLGA微球（celecoxib-poly lactide-co-glycolide microsphere，CEL-PLGA-MS），觀察其緩釋性和在玻璃體腔注藥后對(duì)視網(wǎng)膜的安全性，以達(dá)到抑制實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管（CNV）的目的。 方法： 1塞來昔布-聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球制備。 1.1采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備塞來昔布-PLGA微球（CEL-PLGA-MS）。 1.2采用掃描電鏡觀察CEL-PLGA-MS的形態(tài),粒度分析儀測(cè)量其粒徑。 1.3用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定CEL-PLGA-MS的載藥量。 1.4采用動(dòng)態(tài)膜透析法測(cè)定CEL-PLGA-MS的體外釋放特性。 1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及回收率和精密度試驗(yàn)。 2玻璃體腔注射塞來昔布-PLGA微球的安全性研究。 2.1將36只雄性BN大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：CEL-PLGA-MS組16只，分為4個(gè)劑量組，分別玻璃體腔注入含celecoxib40μM、80μM、160μM、320μM；celecoxib組16只，分為4個(gè)劑量組，分別玻璃體腔注入celecoxib40μM、80μM、160μM、320μM；對(duì)照組4只，2只雙眼玻璃體腔注入0.01M PBS溶液，2只雙眼不處理。 2.2藥物配制、消毒和玻璃體腔注藥。 2.3注藥后7d、14d、28d用裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡及彩色照相機(jī)觀察記錄眼前節(jié)及眼底情況；OCT測(cè)量視網(wǎng)膜厚度（距視盤1DD）。 2.4注藥后7天，石蠟切片觀察各組視網(wǎng)膜各層微結(jié)構(gòu)的變化，透射電鏡觀察各組視網(wǎng)膜細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。 2.5對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行析因分析。 3玻璃體腔注射塞來昔布-PLGA微球抑制實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管的研究。 3.1將32只雄性BN大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：CEL-PLGA-MS組8只，雙眼玻璃體腔注入含celecoxib320μM微球；celecoxib組8只，雙眼玻璃體腔注入celecoxib80μM;空白PLGA組8只，雙眼玻璃體腔注入空白PLGA微球；PBS組8只，雙眼玻璃體腔注入0.01M PBS溶液。 3.2氪激光光凝BN大鼠視網(wǎng)膜建立CNV模型。 3.3藥物配制、消毒和玻璃體腔注藥。 3.4造模注藥后14d，熒光素眼底血管造影法（FFA）觀察各組CNV生成情況的不同，光學(xué)相干斷層成像術(shù)（OCT）測(cè)量各組視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜纖維血管增生(fibrovascular proliferation, FVP)的厚度不同，病理切片觀察各組FVP結(jié)構(gòu)和厚度的不同。 3.5造模注藥后7d、28d實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法測(cè)定各組VEGF mRNA和COX-2mRNA表達(dá)的不同 3.6對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析和析因分析。 結(jié)果: 1塞來昔布-聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球制備。 1.1掃描電鏡下CEL-PLGA-MS呈球形，大小均勻，表面光滑，分散性好。粒度分析儀測(cè)量其粒徑平均為2467.9±18.0nm。 1.2CEL-PLGA-MS平均載藥量為7.77%，體外釋放45d，累積釋放百分率80.91%，緩釋作用明顯。 1.3HPLC測(cè)定：在254nm波長下，塞來昔布在1-80μg·ml-1范圍內(nèi)，濃度C(μg·ml-1)與吸光度(A)線性關(guān)系良好�；厥章屎途芏攘己茫芏萊SD小于1%，低、中、高三個(gè)濃度的平均回收率為100.07±0.01%，符合測(cè)定要求。 2玻璃體腔注射塞來昔布-PLGA微球的安全性研究。 2.1裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡檢查所有實(shí)驗(yàn)大鼠在玻璃體腔注藥后各時(shí)間點(diǎn)，前節(jié)及玻璃體未見明顯炎性反應(yīng)。CEL-PLGA-MS組中160μM劑量組的大鼠有2只眼玻璃體出血。 2.2OCT檢查：注藥后第一周，OCT測(cè)量各注藥組視網(wǎng)膜厚度均大于正常對(duì)照組(174.20±3.36μm)，但CEL-PLGA-MS組視網(wǎng)膜厚度小于celecoxib組(F=165.15P0.01)；CEL-PLGA-MS組中除160μM組外，各組視網(wǎng)膜厚度大致相等(F=4.79P0.01)；celecoxib組中320μM組、160μM組視網(wǎng)膜厚度大于80μM組和40μM組(F=28.10P0.01)。注藥后第二周各注藥組視網(wǎng)膜厚度逐漸減小，到第四周CEL-PLGA-MS組視網(wǎng)膜厚度和正常對(duì)照組大致相等(F=2.06P0.05)，celecoxib組視網(wǎng)膜厚度減小但仍大于正常對(duì)照組(F=2.59P0.05)。 2.3光鏡下各組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)未見明顯異常，但celecoxib組中320μM組、160μM組神經(jīng)纖維層較對(duì)照組明顯增厚，余注藥組輕度增厚，與OCT觀察結(jié)果相同。電鏡下celecoxib組中320μM組、160μM組視網(wǎng)膜毒性反應(yīng)重，且視網(wǎng)膜內(nèi)層細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比外層變化明顯，余各注藥組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化輕微。 3玻璃體腔注射塞來昔布-PLGA微球抑制實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管的研究。 3.1造模注藥后14d，OCT圖像中距視盤1.5~2DD，視網(wǎng)膜層間可見梭形高反射信號(hào)即為FVP膜。測(cè)量的各組FVP平均厚度值中，空白PLGA組和PBS組厚度值大致相等（P0.05），并且明顯高于其余兩組（P0.01）。CEL-PLGA-MS組FVP平均厚度值低于celecoxib組（P0.01）。 3.2FFA晚期圖像（10min），空白PLGA組和PBS組視網(wǎng)膜光凝斑熒光素滲漏明顯，celecoxib組和CEL-PLGA-MS組視網(wǎng)膜光凝斑熒光素?zé)o或部分滲漏。 3.3組織病理切片光鏡下視網(wǎng)膜光凝區(qū)中，空白PLGA組和PBS組纖維血管增生程度明顯高于celecoxib組和CEL-PLGA-MS組。各組FVP平均厚度變化與OCT結(jié)果相一致。 3.4RT-PCR測(cè)定各組COX-2mRNA中，空白PLGA組和PBS組RQ值沒有明顯差異（P0.05），第一周空白PLGA組和PBS組RQ值明顯高于其余兩組（P0.01），并且CEL-PLGA-MS組高于celecoxib組（P0.01）,第四周celecoxib組RQ值明顯高于CEL-PLGA-MS組（P0.01），和PBS組沒有明顯差異（P0.05），但低于空白PLGA組（P0.01）;測(cè)定各組VEGF mRNA中，空白PLGA組和PBS組RQ值沒有明顯差異（P0.05），第一周celecoxib組和CEL-PLGA-MS組RQ值沒有顯著差異（P0.05），但明顯低于空白PLGA組和PBS組（P0.01），第四周celecoxib組RQ值明顯高于CEL-PLGA-MS組（P0.01），但這兩組明顯低于空白PLGA組和PBS組(P0.01)。 結(jié)論: 1制備方法可行，CEL-PLGA-MS形態(tài)圓整、粒徑均勻、大小適宜、體外釋放有良好的緩釋效果。 2CEL-PLGA-MS與原料藥celecoxib相比對(duì)視網(wǎng)膜安全性更好，有望成為一種理想的防治脈絡(luò)膜新生血管的新的臨床用藥。 3塞來昔布PLGA微球（CEL-PLGA-MS）能夠抑制實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管（CNV），并且比celecoxib作用時(shí)間更持久。
【關(guān)鍵詞】：塞來昔布 PLGA 緩釋微球 脈絡(luò)膜新生血管 體外釋放
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R943;R773.4
【目錄】：

• 摘要5-9
• ABSTRACT9-15
• 引言15-17
• 第一部分 塞來昔布-聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球制備17-28
• 前言17
• 材料與方法17-19
• 結(jié)果19-21
• 附圖21-24
• 附表24-26
• 討論26-27
• 小結(jié)27
• 參考文獻(xiàn)27-28
• 第二部分 玻璃體腔注射塞來昔布-PLGA 微球的安全性研究28-41
• 前言28
• 材料與方法28-30
• 結(jié)果30-31
• 附圖31-37
• 附表37-38
• 討論38-39
• 小結(jié)39
• 參考文獻(xiàn)39-41
• 第三部分 玻璃體腔注射塞來昔布-PLGA 微球抑制實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管的研究41-56
• 前言41
• 材料與方法41-45
• 結(jié)果45-46
• 附圖46-51
• 附表51-52
• 討論52-54
• 小結(jié)54
• 參考文獻(xiàn)54-56
• 結(jié)論56-57
• 綜述 環(huán)氧化酶-2 抑制劑抑制眼部新生血管研究進(jìn)展57-65
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 致謝65-66
• 個(gè)人簡歷66

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1084330