發(fā)布時(shí)間：2017-10-02 10:21

  本文關(guān)鍵詞：缺氧預(yù)處理對(duì)心臟干細(xì)胞在缺血環(huán)境中生存的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：目的:動(dòng)脈粥樣硬化所致的心肌梗死、腦血管疾病和周圍血管疾病等,在近年來(lái)世界范圍內(nèi)已成為中老年人死亡的主要原因之一。干細(xì)胞治療則是針對(duì)這些缺血性疾病所出現(xiàn)的一種新的治療策略,其中CSCs是目前研究的熱點(diǎn),其自我更新、克隆增殖和多向分化的能力,在心臟損傷修復(fù)和維持心臟結(jié)構(gòu)和功能完整性方面具有重要作用,而c-kit+CSCs是心肌組織內(nèi)最特異性的干細(xì)胞。但是在移植區(qū)域惡劣的微環(huán)境大大降低了干細(xì)胞的作用。細(xì)胞預(yù)處理是改善這一現(xiàn)象的重要手段,其中缺氧預(yù)處理則是保護(hù)細(xì)胞的臨床可行的方法。多項(xiàng)研究均顯示缺氧預(yù)處理對(duì)多種細(xì)胞的保護(hù)作用。缺氧條件下,Nrf2及其激活的下游基因HO-1在細(xì)胞生存和抵抗不良環(huán)境的防御方面具有關(guān)鍵的作用。研究顯示HIF-1α及下游靶基因VEGF對(duì)細(xì)胞有促生存作用,特別是VEGF以旁分泌方式改善內(nèi)皮細(xì)胞生存和血管生成,且Nrf2活性與HIF-1α的表達(dá)水平呈正相關(guān)。但目前尚未有缺氧預(yù)處理(HPC)對(duì)CSCs中Nrf2/ARE通路的作用及相關(guān)機(jī)制的報(bào)道。因此,本研究擬通過缺氧預(yù)處理心臟干細(xì)胞后檢測(cè)其在不同狀態(tài)下的細(xì)胞存活情況,并檢測(cè)Nrf2、HIF-1α及VEGF等指標(biāo)的表達(dá)情況,以初步探討其作用及相關(guān)機(jī)制。方法:1.按照本課題組前期已成熟的CSCs培養(yǎng)方法培養(yǎng)SD大鼠的CSCs,通過免疫磁珠法篩選c-kit+CSCs,行流式細(xì)胞術(shù)鑒定其純度,并進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn);2.以不同缺血時(shí)間(0,12,24h)處理CSCs,收集細(xì)胞后行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CSCs的細(xì)胞周期,確定模擬缺血微環(huán)境的最佳時(shí)間;3.以不同缺氧時(shí)間(0,6,12,24,30h)處理CSCs,通過CCK8法檢測(cè)不同處理組CSCs的細(xì)胞活力,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組CSCs的凋亡率、存活率及壞死率,確定缺氧預(yù)處理CSCs的最佳時(shí)間;4.對(duì)照組不予任何處理,缺氧組只缺氧處理6h;缺血組只缺血處理24h;缺氧+缺血組在缺氧處理6h后再進(jìn)行缺血處理,然后收集各組細(xì)胞行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組CSCs的凋亡;5.對(duì)照組不予任何處理,缺氧組只缺氧處理6h;缺血組只缺血處理24h;缺氧+缺血組在缺氧處理6h后再進(jìn)行缺血處理,免疫熒光檢測(cè)Nrf2在不同處理中的表達(dá)情況;Western blot檢測(cè)Nrf2、HO-1、HIF-1α及VEGF在各組中的蛋白表達(dá)情況;6.對(duì)照組不予任何處理,Nrf2(+)組用tBHQ處理12h,缺氧組只缺氧處理6h,Western blot檢測(cè)HIF-1α及VEGF在各組中的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1.體外分離培養(yǎng)的原代CSCs在第3天時(shí)呈圓形亮點(diǎn)狀貼于培養(yǎng)瓶底部;培養(yǎng)至第7天時(shí)貼壁良好,細(xì)胞呈梭形、三角形、多角形;在第12天時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)均勻,大約可達(dá)到80%-90%的融合。磁珠分選后的CSCs在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞呈圓點(diǎn)狀散布于培養(yǎng)基中,表面結(jié)合有單個(gè)或多個(gè)磁珠,在3天左右可看到有少量細(xì)胞貼壁,細(xì)胞表面仍有單個(gè)或多個(gè)磁珠結(jié)合,在7天左右細(xì)胞迅速增殖,而且磁珠在鏡下幾乎觀察不到,在10天左右細(xì)胞幾乎鋪滿培養(yǎng)瓶。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CSCs表面標(biāo)記顯示:c-kit+89.8%,CD34 1.9%,CD45 1.7%;2.流式細(xì)胞術(shù)顯示這三組細(xì)胞(缺血0,12,24h)大部分處于G0-G1期,而S期的比例隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低。因此,選定缺血24h來(lái)模擬缺血微環(huán)境;3.CCK8法檢測(cè)不同的缺氧時(shí)間(0,6,12,24,30h)預(yù)處理CSCs的細(xì)胞活力,與對(duì)照組相比,缺氧6h的細(xì)胞活力明顯增加,但隨著時(shí)間增長(zhǎng),細(xì)胞活力無(wú)明顯增加,并且在缺氧30h時(shí)細(xì)胞活力明顯降低;以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各個(gè)處理時(shí)間的細(xì)胞凋亡情況。缺氧6h后細(xì)胞凋亡率增加,為4.5%,與對(duì)照組相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);隨著時(shí)間的延長(zhǎng),凋亡率出現(xiàn)緩慢上升,但與缺氧6h相比,其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);但是當(dāng)缺氧30h時(shí),與對(duì)照組相比,存活率明顯降低,而凋亡率顯著升高,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),由此確定缺氧6h為CSCs缺氧預(yù)處理的最佳時(shí)間;4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理后各組的細(xì)胞凋亡情況,缺氧組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而先進(jìn)行缺氧預(yù)處理后再進(jìn)行缺血的CSCs的細(xì)胞凋亡率與缺血組相比,其凋亡率顯著降低(P0.05)。由此可以證明,缺氧預(yù)處理可以有效地降低缺血導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡;5.免疫熒光顯示Nrf2在缺氧條件下表達(dá)增多;Western blot檢測(cè)顯示與對(duì)照組相比,Nrf2、HO-1、HIF-1α及VEGF的表達(dá)在缺氧條件下增加(P0.05);6.Western blot檢測(cè)顯示與對(duì)照組相比,缺氧預(yù)處理和Nrf2(+)組中的HIF-1α及VEGF的表達(dá)增加(P0.05)。結(jié)論:1.HPC可減少由缺血誘導(dǎo)的CSCs凋亡,其中的機(jī)制可能是通過激活Nrf2/ARE信號(hào)通路,從而發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激及細(xì)胞保護(hù)作用所致的;同時(shí),HPC會(huì)上調(diào)HIF-1α及VEGF的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞生存。2.在CSCs中Nrf2/ARE的激活能夠上調(diào)HIF-1α及VEGF的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：心肌梗死 氧化應(yīng)激 心臟干細(xì)胞 缺氧預(yù)處理 Nrf2/ARE
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54
【目錄】：

• 英漢縮略詞對(duì)照表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 1 材料與方法14-25
• 2 結(jié)果25-36
• 3 討論36-41
• 4 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-47
• 綜述47-55
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 致謝55-57
• 作者簡(jiǎn)介57

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉明波;王文;周脈耕;;2004—2010年中國(guó)心血管病死亡流行趨勢(shì)分析[J];中華流行病學(xué)雜志;2013年10期

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本文編號(hào)：959076