本文關鍵詞：Compound K對動脈粥樣硬化形成的影響及初步機制研究

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【摘要】：動脈粥樣硬化導致的心血管疾病嚴重地影響著人類生命健康�，F(xiàn)有的抗動脈粥樣硬化藥物主要是一些以降血脂為主要目的的藥物,例如貝特類、他汀類、膽汁酸隔離劑、煙酸類等,然而因貝特類、膽汁酸隔離劑和煙酸類藥物易產(chǎn)生嚴重胃腸道不適、肝腎功能損害等副反應,且存在選擇性低、易耐受等局限性,所以現(xiàn)已較少使用。目前使用最廣泛的抗動脈粥樣硬化藥物是他汀類藥物,但其也具有肌肉疼痛、肝臟毒性等副作用。且在已經(jīng)廣泛使用他汀類藥物防治動脈粥樣硬化的情況下,動脈粥樣硬化導致的心血管疾病發(fā)病率仍居高不下,提示除高血脂外,仍可能存在其他危險因素。炎癥免疫因素在動脈粥樣硬化發(fā)病中具有重要作用是近年來的最重要進展之一。本實驗室前期在多種動物模型的研究證明持續(xù)炎癥刺激能夠使動脈粥樣硬化發(fā)病提前、病變加重及斑塊不穩(wěn)定性增加,而抗炎治療則能明顯減輕動脈粥樣硬化形成;與此同時我們觀察到多種細胞因子如IL-1可促使白細胞黏附至內(nèi)皮細胞,IL-18上調(diào)巨噬細胞和內(nèi)皮細胞黏附分子、血管細胞黏附分子的表達,進而與動脈粥樣硬化發(fā)病有密切關系。近年有研究發(fā)現(xiàn)NOD樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein-3,NLRP3)炎癥小體在被多種刺激因素激活后,能切割IL-1β和IL-18的前體,使IL-1β和IL-18成熟并釋放到胞外從而引起炎癥反應。且相較其他亞家族成員而言,NLRP3炎癥小體在血管平滑肌細胞中是最主要的導致成熟IL-1β釋放的因素,因此抑制NLRP3炎癥小體活性極有可能減輕動脈粥樣硬化形成。上述分析提示,從調(diào)節(jié)血脂和降低炎癥反應兩個方面同時采取干預措施將極有望成為防治動脈粥樣硬化的新策略。本實驗室既往研究還發(fā)現(xiàn),作為三七的主要有效部位的三七總皂苷(panax notoginseng Saponins,PNS),其良好防治動脈粥樣硬化的作用與其抗炎作用密切相關;我們的預實驗顯示,作為PNS體內(nèi)代謝活性成分的Compound K(CK,20-O-b-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol)是,具有良好的抗動脈粥樣硬化作用;且PNS減少泡沫細胞形成的作用與其增加LXRα下游靶基因ABCA1的表達水平有關,而且可以通過增加LXRα表達從而減少大鼠動脈粥樣硬化斑塊形成;但其對動脈粥樣硬化形成的系統(tǒng)影響和作用機制尚未見報道。為此,本課題擬系統(tǒng)探討CK對動脈粥樣硬化形成的影響,并從膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(Reverse cholesterol transport,RCT)過程和NLRP3炎癥小體活性兩個方面對其機制進行初步探索。旨在進一步深化對動脈粥樣硬化發(fā)病機理的認識,并為CK的成藥性研究提供實驗依據(jù)。方法:1.實驗動物及處理:雄性C57BL/6 apo E-/-小鼠42只,8周齡,在SPF級房間內(nèi)適應性飼養(yǎng)一周后,被隨機分成7組(n=6),除對照組采用基礎飼料喂養(yǎng)外,其余均進行高脂飲食。每天進行腹腔注射給藥一次,持續(xù)12周。給藥情況如下:對照組給予20ml/kg生理鹽水;模型組在高脂飲食情況下給予20ml/kg生理鹽水;第3、4、5組分別給予1、3、9mg/kg的CK;GGPP組為3mg/kg CK和9mg/kg GGPP混合給藥;阿托伐他汀組劑量為2.6mg/kg。期間每周監(jiān)測并記錄一次小鼠體重變化情況,12周后取材。2.將主動脈竇進行固定和包埋后進行切片,然后作HE染色,倒置顯微鏡下觀察樣品并拍照,進行組織學分析。冰凍病理切片方法用于處理小鼠肝臟組織,然后進行油紅“O”染色,光鏡下觀察肝臟脂質(zhì)沉積情況,并用Nis-Elements BR 3.2軟件進行圖像分析處理。3.對各組小鼠進行摘眼球取血,每只小鼠約取500μl的血樣,立即于4℃離心10min,3000rpm.然后各取200μl上清用AU-2700自動生化分析儀進行血脂指標檢測。4.獲取每只小鼠200μl左右的血清,按照Millpex catalog ID試劑盒步驟,對其中具有代表性的炎癥因子(TNF-α,IL-1β和IL-6)進行表達水平檢測。5.提取小鼠動脈、小腸和肝臟蛋白,檢測動脈中LXRα、ABCA1、ABCG1;小腸ABCG5、ABCG8和肝臟SREBP-1c表達情況。6.提取動脈和肝臟組織的蛋白,用Western blot方法進行目標蛋白NLRP3,Caspase-1及IL-1β等的表達水平檢測。7.培養(yǎng)C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞源泡沫細胞,按如下分組給藥操作:對照組、ox-LDL(100μg/ml)模型組、低劑量CK組(ox-LDL+3.3μM CK)、中劑量CK組(ox-LDL+10μM CK)、高劑量CK組(ox-LDL+30μM CK)、CK+GGPP組(ox-LDL+10μM CK+10μM GGPP)、GW3965組(ox-LDL+10μM GW3965),培養(yǎng)24h,檢測泡沫細胞中膽固醇含量。8.提取C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞源泡沫細胞總蛋白,檢測ABCA1蛋白表達情況。9.對數(shù)生長期細胞用PMA誘導24h使其形成貼壁巨噬細胞后按如下分組處理:對照組、膽固醇(1μg/L)模型組、高劑量GW3965組(膽固醇+30μM GW3965)、中劑量GW3965組(膽固醇+10μM GW3965)、低劑量GW3965組(膽固醇+3.3μM GW3965)、GW3965+GGPP組(10μM GW3965+10μM GGPP)、GGPP組(10μM GGPP)、ABCA1antibody組(10μM GW3965+1:200 ABCA1antibody)、apo E組(10μM GW3965+1:200 apo E antibody)。另外,將誘導成功的巨噬細胞用于檢測LPS的作用,即取100ng/ml LPS作LPS模型組,其余分組為在LPS模型基礎上給予與上述一致的藥物。提取總RNA和總蛋白,檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β等表達。10.培養(yǎng)C57BL/6小鼠腹腔巨噬細胞源泡沫細胞,分組和給藥方式同上所述。提取總蛋白,檢測NLRP3、Caspase-1和IL-1β等表達變化情況。結(jié)果:1.對apo E-/-小鼠動脈進行切片及HE染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),對照組動物主動脈無可見粥樣硬化斑塊,模型組小鼠主動脈則有明顯的病變出現(xiàn),病變面積達15.05±1.97%,3mg/kg和9mg/kg組動物主動脈中斑塊面積都顯著下降為6.58±1.09%和2.16±0.62%。2.光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)油紅“O”染色的模型組小鼠肝臟有大量脂滴沉積在肝臟中,陽性染色面積比為32.00±4.91%;分別給予3mg/kg和9mg/kg的CK處理后,肝臟內(nèi)脂滴明顯減少,陽性面積比分別為11.85±2.40%和4.07±0.76%;同樣地,阿托伐他汀組脂沉積也顯著減少,為4.39±1.08%;GGPP組與模型組相比,無明顯差異。3.模型組apo E-/-小鼠的血清TC,TG,LDL和HDL水平較對照組有顯著增加;阿托伐他汀能明顯下調(diào)TC和LDL水平;與模型組比較,所有CK組的TC和TG水平均無明顯變化,然而3mg/kg CK組和9mg/kg CK組的LDL水平均明顯降低,HDL水平明顯升高;GGPP組較模型組無顯著變化。4.泡沫細胞結(jié)果顯示,與模型組相比,CK可以劑量依賴性地減少泡沫細胞中膽固醇的沉積,GGPP能夠抑制CK的作用從而使泡沫細胞中膽固醇含量增多,GW3965作為CK的陽性對照藥,也能顯著地降低泡沫細胞生成。5.在動物和細胞兩個水平上CK能劑量依賴地增加LXRα,ABCA1及ABCG1等蛋白的表達水平。6.LXRα激動劑GW3965能夠劑量依賴性地降低NLRP3和Caspase-1的m RNA水平(p0.05)和蛋白(p0.05)水平,進而降低成熟IL-1β的產(chǎn)生,GGPP作為LXRα抑制劑能夠顯著抑制GW3965的活性。7.與對照組相比,高脂飲食的模型組中血清炎癥因子IL-1β,IL-6和TNF-α表達水平顯著增高;9mg/kg和3mg/kg的CK能顯著下調(diào)其水平(p0.05);阿托伐他汀僅能減少IL-1β和TNF-α的表達(p0.05),而對IL-6水平無顯著影響;GGPP能明顯抑制CK的作用。8.CK在動物和細胞兩個水平上能劑量依賴性地減少NLRP3,Caspase-1及IL-1β的表達,且GGPP能顯著抑制其作用。結(jié)論:1.CK能夠顯著抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成,且能減少肝臟中脂質(zhì)的沉積。2.CK抑制動脈粥樣硬化形成的作用與促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運和抑制NLRP3炎癥小體活性有關。
【關鍵詞】：組分K 動脈粥樣硬化 GW3965 肝X受體α 膽固醇逆轉(zhuǎn)運 NLRP3炎癥小體
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 縮寫詞表5-7
• 英文摘要7-12
• 中文摘要12-16
• 第一章 前言16-18
• 第二章 Compound K對apo E-/-小鼠主動脈動脈粥樣硬化形成的影響18-30
• 2.1 材料與方法18-22
• 2.2 結(jié)果22-28
• 2.3 討論28-29
• 2.4 小結(jié)29-30
• 第三章 Compound K抑制apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化形成的初步機制研究30-63
• 3.1 Compound K抑制動脈粥樣硬化的形成與激活LXRα 有關30-37
• 3.1.1 材料與方法31-36
• 3.1.2 結(jié)果36-37
• 3.2 Compound K抑制動脈粥樣硬化形成的作用與促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運有關37-41
• 3.2.1 材料與方法37-39
• 3.2.2 結(jié)果39-41
• 3.3 Compound K能夠降低病變局部NLRP3炎癥小體活性41-59
• 3.3.1 材料與方法42-47
• 3.3.2 結(jié)果47-59
• 3.4 討論59-62
• 3.5 小結(jié)62-63
• 全文結(jié)論63
• 特色與展望63-64
• 參考文獻64-69
• 文獻綜述 NLRP3炎癥小體與動脈粥樣硬化69-79
• 參考文獻74-79
• 在讀碩士期間發(fā)表論文79-80
• 致謝80

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 于兆慧;人參稀有皂苷Compound K的酶法制備及其混合膠束的研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2015年

2 周麗;Compound K對動脈粥樣硬化形成的影響及初步機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

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本文編號：934867