發(fā)布時間：2017-09-19 05:16

  本文關鍵詞：FAKsiRNA通過下調mTERF1、CyclinD1抑制低氧誘導下人肺動脈平滑肌細胞增殖機制的研究

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【摘要】：目的:討論低氧誘導下,FAK能否由m TERF1、Cyclin D1信號通路抑制人肺動脈平滑肌細胞增殖。方法:將人肺動脈平滑肌細胞進行原代,利用人工設計、化學合成的人FAK、m TERF1的si RNA脂質體經Lipofectamine2000將轉入人肺動脈平滑肌細胞中。將細胞分為常氧(37℃,5%CO2,21%O2)NCsi RNA組、FAKsi RNA組、m TERF1si RNA組,低氧(37℃、5%CO2、5%O2、90%N2)NCsi RNA組、FAKsi RNA組、m TERF1si RNA組。用Realtime-PCR檢測細胞內FAKm RNA、m TERF1m RNA、Cyclin D1m RNA的水平,Western Blot和FAK、Cyclin D1、m TERF1蛋白質的表達,免疫熒光檢測FAK、Cyclin D1蛋白的表達,CCK8法測定細胞增殖能力。結果:與常氧NCsi RNA組比較,常氧FAKsi RNA組FAKm RNA及蛋白質表達明顯減少(P0.05),而m TERF1、Cyclin D1m RNA及蛋白表達無明顯差異(P0.05);與低氧NCsi RNA組比較,低氧FAKsi RNA組FAKm RNA及蛋白質表達明顯減少(P0.05),而m TERF1 m RNA和m TERF1蛋白質、Cyclin D1m RNA和Cyclin D1蛋白質表達均減少(P0.05);與常氧NCsi RNA組比較,轉染m TERF1si RNA后,常氧m TERF1si RNA組m TERF1m RNA及蛋白質表達明顯減少(P0.05),而FAK、Cyclin D1m RNA及蛋白質表達無明顯變化(P0.05)。與低氧NCsi RNA組比較,轉染m TERF1si RNA后,低氧m TERF1si RNA組m TERF1m RNA及蛋白表達明顯減少(P0.05),低氧下CCND1m RNA和CCND1蛋白表達減少(P0.05),而FAKm RNA及FAK蛋白質表達改變不明顯(P0.05)。免疫熒光檢測顯示常氧FAKsi RNA組與常氧NCsi RNA組相比較,FAK是si RNA熒光表達下降明顯(P0.05),Cyclin D1的熒光表達變化不明顯(P0.05)。低氧下,FAKsi RNA組較NCsi RNA組相比,其FAK熒光表達明顯下降(P0.05),Cyclin D1的熒光表達也隨之降低(P0.05)。結論:低氧誘導下,沉默FAK可致人肺動脈平滑肌細胞m TERF1、Cyclin D1表達減少,且抑制HPASMCs增殖,而沉默m TERF1后Cyclin D1表達減少,FAK表達無明顯改變。提示FAK是通過m TERF1/cyclin D1通路信號參與低氧狀態(tài)下人肺動脈平滑肌細胞的增殖。
【關鍵詞】：低氧 黏著斑激酶 線粒體轉錄終止1 細胞周期蛋白1 肺動脈平滑肌細胞
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R544.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 主要中英文對照9-10
• 主要儀器及試劑10-16
• 前言16-18
• 第1章 原代細胞培養(yǎng)及鑒定18-22
• 1.1 培養(yǎng)原代HPASMCs18-19
• 1.1.1 組織取材18
• 1.1.1.1 取材對象18
• 1.1.1.2 取材地點18
• 1.1.1.3 取材步驟及內容18
• 1.1.2 細胞培養(yǎng)18-19
• 1.1.2.1 肺動脈分離18
• 1.1.2.2 分離肺動脈平滑肌18
• 1.1.2.3 組織貼片法18-19
• 1.1.2.4 細胞傳代19
• 1.2 人肺動脈平滑細胞的鑒定19-22
• 1.2.1 倒置顯微鏡下形態(tài)鑒定20
• 1.2.2 α-actin免疫組化法鑒定20
• 1.2.3 鈣調節(jié)蛋白-1 免疫熒光法鑒定20-22
• 第2章 實驗方法22-34
• 2.1 實驗分組22
• 2.2 細胞轉染22-24
• 2.2.1 小干擾設計及序列號22-23
• 2.2.2 轉染方法及過程23-24
• 2.3 Realtime PCR24-27
• 2.3.1 引物設計及序列號24
• 2.3.2 細胞RNA的提取24-25
• 2.3.3 紫外線吸光法鑒定細胞RNA純度及濃度25-26
• 2.3.4 逆轉錄及cDNA合成26
• 2.3.5 PCR擴增26-27
• 2.4 Western-blot27-31
• 2.4.1 細胞總蛋白提取27-28
• 2.4.2 BCA法測定蛋白濃度28
• 2.4.3 SDS-PAGE電泳28-29
• 2.4.4 轉膜29-30
• 2.4.5 免疫反應30
• 2.4.6 蛋白信號曝光，顯影，定影30-31
• 2.4.7 凝膠圖像分析31
• 2.5 免疫熒光31-32
• 2.6 細胞增殖檢測（CCK8法）32-34
• 第3章 統(tǒng)計分析34-36
• 第4章 實驗結果36-44
• 4.1 RT-PCR檢測FAK、mTERF1、CyclinD1mRNA的表達36-37
• 4.2 Western-Blot檢測FAK、m TERF1、CyclinD1蛋白表達37-39
• 4.3 免疫熒光檢測FAK、CyclinD1蛋白表達39-42
• 4.4 CCK8檢測人肺動脈平滑肌細胞增殖42-44
• 第5章 討論44-48
• 第6章 結論48-50
• 參考文獻50-54
• 附錄54-56
• 綜述 FAK在COPD呼吸道平滑肌細胞增殖中作用機制的研究進展56-68
• 參考文獻65-68
• 致謝68-69

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1 楊慧;FAKsiRNA通過下調mTERF1、CyclinD1抑制低氧誘導下人肺動脈平滑肌細胞增殖機制的研究[D];南華大學;2015年

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本文編號：879701