本文關鍵詞：在體外模擬冠狀動脈痙攣微環(huán)境下下調(diào)Caveolin-1對人臍靜脈內(nèi)皮細胞分泌NO和ET-1的影響

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【摘要】：目的通過體外細胞實驗研究在致內(nèi)皮損傷脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及致冠狀動脈痙攣物質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)微環(huán)境中下調(diào)Caveolin-1(Cav-1)的表達對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(primary human umbilical vein endothelial cell,HUVECs)分泌一氧化氮(nitric oxide,NO)及內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)的影響,初步探索通過下調(diào)Cav-1的表達能否促進NO的產(chǎn)生,降低ET-1的分泌,從而在一定程度上緩解或者抑制冠狀動脈痙攣(CAS)的發(fā)生。方法人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的培養(yǎng)及鑒定。將原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞接種于ECM完全培養(yǎng)基(5%胎牛血清,1%內(nèi)皮細胞生長因子,1%的青霉素/鏈霉素抗生素),37°C含5%CO2的溫箱培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察內(nèi)皮細胞生長情況,免疫熒光法鑒定內(nèi)皮細胞的Ⅷ因子相關抗原。選擇3對小干擾RNA(si RNA)序列下調(diào)Cav-1的表達,Western-blot印跡法檢測Cav-1蛋白表達水平的變化。脂多糖(LPS)構建內(nèi)皮功能損傷模型:分別用不同濃度(0、10、25、50、75、100μg/m L)LPS體外誘導陰性轉染組(HUVECs/si-NC)和Cav-1表達下調(diào)組(HUVECs/si Cav-1),CCK8(cell counting kit-8)法觀察LPS對HUVECs活性的影響。WST-1(一種高度水溶性四唑鹽)法測定檢測細胞上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dimutase,SOD)的抑制率。采用Ach刺激內(nèi)皮細胞構建冠脈痙攣微環(huán)境模型:根據(jù)前期實驗結果,選用75μg/m L的LPS干預內(nèi)皮細胞24h構建內(nèi)皮損傷模型,以此細胞模型為基礎用10μmol/L乙酰膽堿(Ach)模擬冠脈痙攣微環(huán)境:以Ca2+熒光指示劑Fluo4-AM為探針,倒置熒光顯微鏡檢測細胞內(nèi)鈣離子水平([Ca2+]i)的變化評價模型的構建。實驗分組:取3-5代的HUVECs進行實驗。將等量細胞數(shù)接種生長24h后分別加入0、75μg/m L LPS作用24h,更換為含有Ach的孵育液培養(yǎng),分別取上清檢測NO和ET-1的含量。測定NO和ET-1含量,實驗分為8組:(1)HUVECs/si-NC;(2)HUVECs/si-NC+LPS;(3)HUVECs/si-NC+Ach;(4)HUVECs/si-NC+LPS+Ach;(5)HUVECs/si Cav-1;(6)HUVECs/si Cav-1+LPS;(7)HUVECs/si Cav-1+Ach;(8)HUVECs/si Cav-1+LPS+Ach.硝酸還原酶法測定上述各組細胞上清NO含量,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定上述各組細胞上清ET-1含量。結果倒置顯微鏡和免疫熒光結果顯示,在倒置顯微鏡下觀察單個細胞呈典型的鋪路石樣生長,成團的細胞呈魚貫樣或漩渦狀生長。倒置熒光顯微鏡下觀察,DAPI熒光染料著色細胞核呈藍色,胞漿內(nèi)有綠色熒光顆粒,Ⅷ因子表達陽性。Western blot印跡結果顯示,si RNA干擾后Cav-1蛋白表達水平均下降,尤以si Cav-1(2)下調(diào)最明顯。LPS作用24小時誘導內(nèi)皮損傷呈劑量依賴性,LPS濃度在75μg/m L時HUVECs/si-NC和HUVECs/si Cav-1分別與空白對照組相比細胞存活率明顯降低(P0.05),并且在75μg/m L時HUVECs/si-NC和HUVECs/si Cav-1分別與空白對照組相比SOD抑制率下降,有統(tǒng)計學差異(P0.05),間接反映內(nèi)皮細胞損傷模型構建成功。Ach刺激未受損傷的HUVECs/si-NC,[Ca2+]i明顯增加而Ach刺激LPS損傷的HUVECs/si-NC,[Ca2+]i水平變化很小甚至不明顯,說明冠脈痙攣微環(huán)境模擬成功。在Ach刺激下,受損傷的HUVECs/si Cav-1產(chǎn)生的NO較受損傷的HUVECs/si-NC多(P0.05),二者有明顯的統(tǒng)計學差異。Ach刺激受損傷的HUVECs/si Cav-1和受損傷的HUVECs/si-NC,二者ET-1的含量無統(tǒng)計學差異。結論在LPS和Ach共同模擬的冠脈痙攣微環(huán)境下,下調(diào)Cav-1的表達能夠促進HUVECs對NO的分泌,但對ET-1的分泌無影響,本研究為冠脈痙攣的預防和治療提供了新靶點。
【關鍵詞】：Caveolin-1 一氧化氮 內(nèi)皮素-1 脂多糖 乙酰膽堿 冠狀動脈痙攣
【學位授予單位】：首都醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R543.3
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-12
• 材料和方法12-24
• 一．實驗材料12-16
• 二．實驗方法16-24
• 實驗結果24-32
• 1. 原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞的形態(tài)學和免疫熒光學鑒定24
• 2. si Cav-1(2)明顯降低 Cav-1 的蛋白表達水平24-25
• 3. 75μg/ml 脂多糖能顯著降低 HUVECs/si-NC 和 HUVECs/si Cav-1 細胞活性25-26
• 4. 75μg/m L 脂多糖明顯降低 HUVECs/si-NC 和 HUVECs/si Cav-1 細胞 SOD 抑制率26-27
• 5. 受損傷和未受損傷的HUVECs/si-NC細胞內(nèi)鈣離子([Ca2+]i)對Ach的反應27-29
• 6. Ach 刺激損傷細胞時，Cav-1 下調(diào)能促進NO的釋放29-30
• 7. Ach 刺激損傷內(nèi)皮細胞時，，ET-1 的含量無明顯改變30-32
• 討論32-34
• 結論34-35
• 參考文獻35-40
• 綜述40-49
• 參考文獻44-49
• 碩士期間文章發(fā)表情況49-50
• 致謝50-52
• 個人簡歷52-53

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