發(fā)布時間：2017-09-06 18:43

  本文關(guān)鍵詞：生長分化因子-11促進小鼠誘導(dǎo)性多能干細胞心肌細胞定向分化的實驗研究

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【摘要】：背景:隨著社會的發(fā)展和生活水平的改善,心血管疾病已成為全球第一大死因。各種原因引起的心肌損傷均能夠造成的心肌細胞的不可逆缺失,進而導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。雖然成體的心臟中存在著一些內(nèi)源性的心臟干細胞,但是由于其數(shù)量稀少,難以彌補損失的心肌細胞。隨著介入醫(yī)學(xué)的發(fā)展,雖然心血管疾病患者的生存質(zhì)量有了明顯的提高,但是目前的醫(yī)療手段仍無法實現(xiàn)心肌修復(fù),恢復(fù)心功能。再生醫(yī)學(xué)為其治療帶來來了新的希望。其中,誘導(dǎo)性多能干細胞(iPSCs)是一類來源于成體細胞的干細胞,并且具有多向分化潛能。iPSCs能夠分化為心肌細胞,為心肌修復(fù)提供可靠的細胞來源,因此誘導(dǎo)性多能干細胞研究和應(yīng)用迅速的成為熱點。雖然,大量實驗早已成功將iPSCs誘導(dǎo)分化為心肌細胞,但是定向分化效率低下,極大的阻礙了其臨床應(yīng)用。有研究表明生長分化因子-11(GDF-11)能夠激活TGF-β信號通路,而此通路與iPSCs的心肌細胞分化密切相關(guān)。但是,關(guān)于GDF-11促進iPSCs心肌細胞定向分化的作用,尚未見有文獻報道。目的:探討gdf-11對mipscs心肌細胞定向分化的作用和分子機制,為ipscs的臨床治療提供實驗依據(jù)。方法:(1)原代分離小鼠胚胎成纖維細胞(mef),制備小鼠誘導(dǎo)性多能干細胞(mipscs)培養(yǎng)所需的飼養(yǎng)層細胞。(2)mipscs的培養(yǎng)。(3)擬胚體(ebs)的制備和誘導(dǎo)ipscs的心肌細胞分化。(4)gdf-11濃度的優(yōu)選。(5)實時熒光定量pcr檢測各分化階段性的心肌特異性基因表達變化。(6)westernblot檢測心肌結(jié)構(gòu)蛋白ctni表達的變化。(7)免疫熒光染色觀察心肌結(jié)構(gòu)蛋白ctni的表達情況。(8)westernblot檢測tgf-β通路相關(guān)蛋白和線粒體功能蛋白pgc-1α的表達水平,對機制進行分析。結(jié)果:(1)光鏡下mipscs復(fù)蘇后第二天即可形成圓形或者橢圓形的克隆,克隆團內(nèi)細胞排列緊密,細胞邊界清晰。通過懸滴法誘導(dǎo)mipscs形成的ebs大小均一,分化至第8天可見ebs外圍的細胞分化成為搏動的心肌樣細胞團塊。(2)通過觀察不同濃度gdf-11對ctni和α-mhc表達的影響,最終確定gdf-11工作濃度為10ng/ml。(3)實時熒光定量pcr檢測心肌特異性標(biāo)志物的表達,結(jié)果顯示:gdf-11組的oct-4表達水平較對照組顯著降低(p0.01);gdf-11促進了flk-1和nkx2.5的表達(p0.01);ctnt的表達水平較對照組也有明顯的升高(p0.01)。(4)兩組均出現(xiàn)了搏動的心肌樣細胞團,gdf-11組搏動ebs百分比要顯著高于對照組(p0.01)。(5)westernblot顯示gdf-11能夠增強心肌結(jié)構(gòu)蛋白ctni的表達;免疫熒光染色顯示,gdf-11組的ctni陽性率要顯著高于對照組(p0.01)。(6)Western blot顯示GDF-11處理組的TGF-β、Smad2、以及PGC-1α均有顯著的上升(P0.05)。結(jié)論:GDF-11能夠提高心肌早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和心肌細胞標(biāo)志物cTn I的表達水平,促進miPSCs的心肌細胞分化進程,提高心肌分化效率。GDF-11的這種作用可能與TGF-β/Smad2信號通路的活化以及線粒體功能的提高相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：生長分化因子-11 小鼠誘導(dǎo)性多能干細胞 心肌分化 TGF-β信號通路
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 文獻回顧15-26
• 1 心血管病流行病學(xué)現(xiàn)狀15-16
• 2 心肌缺血損傷與再生修復(fù)16-21
• 3 誘導(dǎo)性多能干細胞21-24
• 4 生長分化因子-11（GDF-11）概述和其與干細胞分化的研究現(xiàn)狀24-26
• 第一部分 飼養(yǎng)層細胞的制備以及mi PSCs的培養(yǎng)26-33
• 1 材料26-28
• 2 方法28-30
• 3 結(jié)果30-31
• 4 討論31-33
• 第二部分 GDF-11 對mi PSCs心肌分化的影響33-48
• 1 材料33-36
• 2 方法36-40
• 3 結(jié)果40-44
• 4 討論44-48
• 第三部分 GDF-11 促進mi PSCs心肌分化的機制分析48-54
• 1 材料48-49
• 2 方法49-50
• 3 結(jié)果50-51
• 4 討論51-54
• 小結(jié)54-55
• 參考文獻55-69
• 個人簡歷和研究成果69-70
• 致謝70

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本文編號：804811