本文關(guān)鍵詞：miR-223-3p基因沉默對(duì)AMI大鼠CMECs血管生成的影響及其AMI患者益氣活血中藥干預(yù)研究

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【摘要】：目的1.前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)益氣活血中藥干預(yù)前后miR-223-3p在缺血心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中具有差異性表達(dá),并發(fā)現(xiàn)miR-223-3p可能通過(guò)影響RPS6KB1/HIF-1a信號(hào)通路抑制缺血心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Cardiac Microvascular Endothelial Cells,CMECs)的遷移和增殖,從而抑制血管生成。本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù),進(jìn)一步論證miR-223-3p抑制血管生成的機(jī)理。2.觀察益氣活血中藥干預(yù)急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)患者前后血漿中miR-223-3p的動(dòng)態(tài)變化,探討miR-223-3p作為急性心肌梗死標(biāo)志物的可行性及靈敏度,為急性心肌梗死的診斷提供更多依據(jù)。方法1.實(shí)驗(yàn)研究(1)在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,獲取病毒載體,建立急性心梗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,觀察正常組(ZC)、模型組(MX)、轉(zhuǎn)染空病毒組(AD-EGFP)、轉(zhuǎn)染miR-223-3p干擾基因組(AD-miR-223-3p)血管新生的生物學(xué)特征,噻唑藍(lán)(MTT)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,劃痕法測(cè)定細(xì)胞遷移能力,倒置相差顯微鏡觀察管腔結(jié)構(gòu)形成情況;確定CMECs血管新生的遷移、增殖、成管的窗口期。(2)根據(jù)四組細(xì)胞增殖、遷移、成管的窗口期,取最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)、最佳窗口期,Trizol提取四組總RNA,運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)各組miR-223-3P的表達(dá)。(3)Western-blot檢測(cè)靶基因及HIF-1α、VEGF、MAPK、PI3K、AKT的蛋白表達(dá)。2.臨床研究(1)選擇AMI住院患者28例,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組各14例。實(shí)驗(yàn)組給予常規(guī)西藥聯(lián)合益氣活血中藥治療,對(duì)照組給予常規(guī)西藥治療,同時(shí)選擇10例健康志愿者入組。在入院后1h、7天、14天檢測(cè)兩組miR-223-3p的表達(dá)情況。(2)檢索文獻(xiàn),查找并發(fā)現(xiàn)miR-208及miR-133a急性心梗特異性miRNA的表達(dá)規(guī)律,比較三者的表達(dá)時(shí)間窗。結(jié)果1.實(shí)驗(yàn)研究(1)本研究共制作60例大鼠急性心梗模型,其中,成功存活大鼠54只,死亡6只,模型制作成功率90%。(2)腺病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示,接種腺病毒24小時(shí)后,6組和60組僅有少量綠色熒光表達(dá),轉(zhuǎn)染率為5%和20%;余三組均有大量綠色熒光表達(dá),轉(zhuǎn)染率分別為89%、98%、99%。接種腺病毒48小時(shí)后,6組和60組熒光表達(dá)未見(jiàn)增多;600組、6000組熒光表達(dá)強(qiáng)烈,60000組熒光表達(dá)減少,6000組和60000組孔內(nèi)細(xì)胞見(jiàn)細(xì)胞膜破裂,大量細(xì)胞懸浮死亡。(3)ZC組、MX組、AD-EGFP組、AD-miR-223-3p組細(xì)胞增殖窗口期分別為第3天、第6天、第6天、第3天;四組細(xì)胞遷移和成管窗口期分別為第1天和第2天。ZC組和AD-miR-223-3p增殖率、遷移率和成管率均高于MX組和AD-EGFP組(P0.05)。(4)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-223-3p表達(dá)水平,與ZC組比較,MX組、AD-EGFP組、AD-miR-223-3p組均上調(diào);與MX組比較,ZC組、AD-miR-223-3p組表達(dá)水平下調(diào)。與ZC組比較,MX組Rps6kb1 m RNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P0.05),AD-EGFP組Rps6kb1m RNA表達(dá)上調(diào)(P0.01),AD-miR-223-3p組表達(dá)下調(diào)(P0.05);與MX組比較,AD-miR-223-3p組Rps6kb1 m RNA的表達(dá)水平下調(diào)(P0.05),而AD-EGFP組Rps6kb1m RNA表達(dá)上調(diào)(P0.01)。四組細(xì)胞信號(hào)通路m RNA表達(dá)結(jié)果顯示,與ZC組相比,MX組和AD-EGFP組MAPK、AKT和VEGF的m RNA表達(dá)均明顯降低(P0.05),AD-miR-223-3p組HIF-1α、PI3K、MAPK和VEGF基因表達(dá)均明顯下調(diào)(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與MX組相比,AD-EGFP組AKT、MAPK和VEGF表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ZC組和AD-miR-223-3p組HIF-1α、PI3K、AKT和VEGF基因均顯著升高(P0.01)。(5)Western-blot檢測(cè)結(jié)果回示,與ZC組比較,MX組、AD-EGFP組和AD-miR-223-3p組靶基因蛋白水平均降低(P0.01或P0.05)。與MX組比較,靶基因蛋白表達(dá)在AD-miR-223-3p組明顯升高,AD-EGFP組無(wú)明顯差異。四組細(xì)胞信號(hào)通路蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,與ZC組相比,MX組和AD-EGFP組MAPK、AKT和VEGF的蛋白表達(dá)均明顯降低(P0.05),AD-miR-223-3p組HIF-1α、PI3K、MAPK和VEGF基因表達(dá)均明顯下調(diào)(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與MX組相比,AD-EGFP組AKT、MAPK和VEGF表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ZC組和AD-miR-223-3p組HIF-1α、PI3K、AKT和VEGF基因均顯著升高(P0.01)。2.臨床研究(1)心電圖療效比較兩組患者入院1小時(shí)心電圖和出院前心電圖結(jié)果。對(duì)照組總有效率71.43%,實(shí)驗(yàn)組總有效率85.71%,經(jīng)秩和檢驗(yàn),結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,實(shí)驗(yàn)組療效優(yōu)于對(duì)照組。(2)血漿miR-223-3p動(dòng)態(tài)表達(dá)與健康志愿者相比,入院1小時(shí)所抽取肘靜脈血中,AMI患者miR-223-3p表達(dá)明顯升高(P=0.000.05)。而對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組在治療前miR-223-3p表達(dá)的表達(dá)量無(wú)明顯差異(P=0.6250.05)。AMI患者miR-223-3p的表達(dá)于入院是即為高峰階段,治療后呈持續(xù)下降趨勢(shì)。治療7天內(nèi)下降最為明顯,而14天后趨于平穩(wěn)。兩組患者miR-223-3p的表達(dá)治療后均較治療前降低,而應(yīng)用益氣活血中藥治療后效果更明顯(P0.05)。結(jié)論1.腺病毒轉(zhuǎn)染缺血CMECs的最佳MOI在300-600之間,轉(zhuǎn)染時(shí)間于12-18小時(shí)可達(dá)到最大轉(zhuǎn)染效率,而且對(duì)細(xì)胞損傷較小。2.miR-223-3p沉默,可以促進(jìn)CMECs的增殖、遷移、成管過(guò)程,進(jìn)而促進(jìn)血管新生。3.進(jìn)一步證實(shí)miR-223-3p是通過(guò)Rps6kb1/HIF-1α信號(hào)通路使血管生成關(guān)鍵分子VEGF、p38 MAPK、PI3K、AKT等表達(dá)水平升高,促進(jìn)缺血心肌血管生成。4.心肌梗死發(fā)病初始,miR-223-3p較miR-133和miR-208會(huì)更早進(jìn)入窗口期。
【關(guān)鍵詞】：益氣活血中藥 急性心肌梗死 mir-223-3p 腺病毒轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R542.22
【目錄】：

• 提要3-6
• abstract6-10
• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照10-15
• 引言15-17
• 第一部分 實(shí)驗(yàn)研究17-51
• （一）miR2233p沉默大鼠缺血CMECs的生物學(xué)特性17-33
• 1 實(shí)驗(yàn)材料17-18
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17
• 1.2 主要儀器17-18
• 1.3 主要試劑18
• 2 試驗(yàn)方法18-21
• 2.1 大鼠急性心梗（AMI）模型制作 結(jié)扎法18-19
• 2.2 缺血心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)植塊法19
• 2.3 腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠缺血CMECs19-20
• 2.4 各組CMECs的生物學(xué)特性20-21
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析21
• 3 結(jié)果21-29
• 3.1 大鼠急性心梗模型制作結(jié)果21-22
• 3.2 大鼠缺血CMECs的生長(zhǎng)情況22-23
• 3.3 腺病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果23-26
• 3.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線26
• 3.5 遷移結(jié)果26
• 3.6 CMECs成管情況26-28
• 3.7 各組CMECs生長(zhǎng)窗口期和增殖率、遷移率、成管率情況28-29
• 4 討論29-33
• （二）miR2233p沉默對(duì)缺血CMECs血管新生功能的影響33-51
• 1 實(shí)驗(yàn)材料33-37
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物33
• 1.2 主要儀器33-34
• 1.3 主要試劑34
• 1.4 主要溶液配制方法34-37
• 2 實(shí)驗(yàn)方法37-43
• 2.1 RT-PCR檢測(cè)miR2233p及相關(guān)靶基因表達(dá)38-41
• 2.2 Western-blot[32]檢測(cè)靶基因蛋白表達(dá)41-42
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析42-43
• 3 結(jié)果43-48
• 3.1 各組miR2233p差異表達(dá)43-45
• 3.2 Rps6kb1的mRNA和蛋白表達(dá)情況45-46
• 3.3 信號(hào)通路mRNA和蛋白表達(dá)46-48
• 4 討論48-51
• 第二部分 臨床研究 益氣活血中藥干預(yù)miR2233p對(duì)急性心肌梗死診斷價(jià)值51-62
• 1 資料與方法51-53
• 1.1 受試者的選擇51-52
• 1.2 受試者分組52
• 1.3 治療藥物52-53
• 1.4 觀察指標(biāo)53
• 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析53
• 2 結(jié)果53-59
• 2.1 一般資料53-56
• 2.2 治療前后心電圖療效評(píng)價(jià)56-57
• 2.3 循環(huán)血中miR2233p表達(dá)情況57-59
• 2.4 miR2233p、miR-133a和miR-208的動(dòng)態(tài)表達(dá)59
• 3 討論59-62
• 結(jié)語(yǔ)62-63
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 綜述67-75
• 參考文獻(xiàn)72-75
• 附錄75-83
• 發(fā)表論文83-85
• 參加課題85-87
• 致謝87-89
• 附件89-99

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本文編號(hào)：797609