本文關(guān)鍵詞：利用大鼠原代心肌細(xì)胞研究HZFHG5a

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【摘要】：心肌肥大的發(fā)病機(jī)制一直以來是心血管疾病研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,近年來對于心肌肥大的發(fā)生已取得很大的進(jìn)展,但是其分子機(jī)制仍遠(yuǎn)未闡明。因此,研究清楚心肌肥大發(fā)生的相關(guān)分子機(jī)制對闡明心臟病的發(fā)病機(jī)理、基因診斷并最終利用分子干預(yù)手段治療心臟病,都具有非常重要的意義。心肌肥大是心肌細(xì)胞對高血壓、瓣膜病、急性心肌梗死及先天性心臟病等常見臨床疾病的一種基本應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)室前期工作已經(jīng)從心臟cDNA文庫中克隆得到人類新基因HZFHG5a。通過組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)HZFHG5a主要在小鼠的腸、腎、肝、心臟中表達(dá)。免疫共沉淀結(jié)果證明了HZFHG5a能與TGF-β信號通路中的SMAD6/7發(fā)生相互作用。同時(shí)利用HZFHG5a基因過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)HZFHG5a能夠部分抑制TGF-β信號通路中由TGF-β刺激所引起的SMAD2/3蛋白的磷酸化程度,進(jìn)而抑制SMAD4蛋白的穿核過程。由此可見HZFHG5a很可能通過TGF-β信號通路參與調(diào)控心肌肥大的發(fā)生。為了進(jìn)一步研究HZFHG5a調(diào)控肥大的分子機(jī)制,我們首先在HEK293A細(xì)胞系中擴(kuò)增了HZFHG5a腺病毒質(zhì)粒。其次分離新生大鼠心肌細(xì)胞,使用腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,并利用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測了HZFHG5a的表達(dá),以及經(jīng)PE或10%FBS誘導(dǎo)后肥大標(biāo)志基因ANF、β-MHC、SKA的表達(dá)。最后,我們在H9C2細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染HZFHG5a質(zhì)粒過表達(dá)HZFHG5a以及熒光報(bào)告質(zhì)粒,檢測心臟發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明,過表達(dá)HZFHG5a能上調(diào)肥大標(biāo)志基因ANF、β-MHC、SKA的表達(dá),提示該基因可能與心肌肥大的發(fā)生有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：HZFHG5a 心肌肥大 腺病毒 新生大鼠心肌細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R542.2
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 1 引言和文獻(xiàn)綜述10-21
• 1.1 心肌肥大的研究10-11
• 1.2 心肌肥大的分類11-12
• 1.3 遺傳學(xué)上對于心肌肥大和心衰的研究12-13
• 1.4 心肌肥大和心衰發(fā)生的分子機(jī)制13-14
• 1.5 TGF-β信號途徑與心肌肥大的關(guān)系14-17
• 1.6 SMAD分子和心肌肥大的關(guān)系17-18
• 1.7 腺病毒的相關(guān)研究18-19
• 1.8 HZFHG5a基因的研究進(jìn)展及本文研究意義19-21
• 2 材料和方法21-34
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 生物信息學(xué)軟件21
• 2.1.2 菌株和質(zhì)粒21-22
• 2.1.3 細(xì)胞22
• 2.1.4 器材22-23
• 2.2 方法23-34
• 2.2.1 腺病毒的擴(kuò)增23-24
• 2.2.2 大鼠原代心肌細(xì)胞的分離24-25
• 2.2.3 腺病毒轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞25
• 2.2.4 體外刺激心臟細(xì)胞肥大模型25-26
• 2.2.5 細(xì)胞中總RNA的提取26-27
• 2.2.6 RNA逆轉(zhuǎn)錄27
• 2.2.7 PCR引物設(shè)計(jì)與合成27-28
• 2.2.8 RT-PCR與瓊脂糖凝膠電泳28
• 2.2.9 細(xì)胞蛋白的提取28
• 2.2.10 SDS-PAGE凝膠配制28-29
• 2.2.11 Western blot免疫印記29-30
• 2.2.12 培養(yǎng)細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記方法30
• 2.2.13 無內(nèi)毒素試劑盒提取質(zhì)粒30-31
• 2.2.14 細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染31
• 2.2.15 熒光素酶報(bào)告基因活性分析實(shí)驗(yàn)（Luciferase）31-32
• 2.2.16 LacZ報(bào)告基因檢測32
• 2.2.17 酶切產(chǎn)物的純化回收32
• 2.2.18 酶切產(chǎn)物與載體的連接32-33
• 2.2.19 轉(zhuǎn)化(熱休克法)33-34
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其分析34-43
• 3.1.擴(kuò)增Ad HZFHG5a腺病毒載體轉(zhuǎn)染 293A細(xì)胞34-35
• 3.2 分離原代大鼠心肌細(xì)胞35-36
• 3.3 腺病毒轉(zhuǎn)染新生大鼠原代心肌細(xì)胞36
• 3.4 RT-PCR分析HZFHG5a基因?qū)τ诓±硇苑蚀蟮挠绊?/span>36-38
• 3.5 Western-bolt分析HZFHG5a基因?qū)τ贏NF的影響38
• 3.6 HZFHG5a過表達(dá)增大心肌細(xì)胞表面積38-39
• 3.7 HZFHG5a對SMAD4入核的影響39-40
• 3.8 HZFHG5a對ANF-luc、β-MHC-luc、CAGA-luc、NFAT-luc轉(zhuǎn)錄活性分析40-43
• 4 討論43-45
• 5 結(jié)語45-46
• 參考文獻(xiàn)46-51
• 附錄一51-52
• 致謝52-53

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本文編號：778758