本文關鍵詞：MicroRNAs在老年性竇房結(jié)功能減退中的作用及機制研究

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【摘要】：一、背景與目的老年竇房結(jié)功能減退病人數(shù)量逐年增加,給社會造成極大負擔,但是目前診斷這種疾病的檢查方法有限,不能做到早期診斷,給治療帶來很大不便。近些年來關于疾病生物標志物的研究快速發(fā)展,特別是楊寶峰等關于microRNAs在心肌梗死中作用的研究,不僅啟發(fā)我們提出有關老年竇房結(jié)功減退疾病生物診斷標志物的研究方向,并給我們的研究提供了方法參考。1.microRNAsmicroRNAs是長度為20-25nt的單鏈非編碼RNAs,其發(fā)揮生物功能主要方式：與mRNAs互補或者非互補方式結(jié)合降低mRNAs穩(wěn)定性,使靶基因的表達下調(diào);與mRNAs結(jié)合,阻斷蛋白翻譯過程,使靶基因表達降低。最新的研究證明,nicroRNAs除了在近幾年來的研究證明,microRNAs在組織器官分化發(fā)育與疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。此外,對其在臨床疾病診療中的應用研究表明,microRNAs可作為疾病的生物診斷標志物,如今在心肌損害、腫瘤以及肝功能監(jiān)測中已經(jīng)得到廣泛關注與應用。2.老年竇房結(jié)功能減退竇房結(jié)位于界嵴附近,是心臟跳動的起搏中心。隨著年齡增長,竇房結(jié)及其周圍組織逐漸纖維化,竇房結(jié)細胞和各種過渡細胞發(fā)生凋亡而減少。同時竇房結(jié)細胞起搏相關離子通道蛋白基因表達變化,起搏電流譜改變。可能在這兩種機制的共同作用下,竇房結(jié)起搏功能逐漸減退,具體表現(xiàn)為固有心率的下降和竇房結(jié)傳導時間的延長。由于竇房結(jié)功能減退與心血管嚴重程度和死亡率明顯相關而日益受到人們的重視。3.起搏相關基因起搏相關基因是一些影響竇房結(jié)細胞四期自動除極的離子通道蛋白基因,以及影響竇房結(jié)內(nèi)信號傳導的縫隙連接蛋白基因。研究發(fā)現(xiàn),主要有超級化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道基因、L型鈣通道基因、鉀離子通道基因與縫隙連接蛋白基因。隨年齡增長,這些竇房結(jié)內(nèi)基因的表達可發(fā)生重塑,導致固有心率下降。已經(jīng)通過動物實驗證明。近來的研究證明,microRNAs與細胞凋亡、炎癥、離子通道的重塑可能存在密切關系。為了尋找老年竇房結(jié)功能減退的疾病生物診斷標志物并闡明其發(fā)病機制,我們通過探索老年竇房結(jié)功能異常的病人血液中是否存在microRNAs異常表達,通過表達譜芯片及熒光定量PCR驗證,從中挑選出三個我們認為差異性明顯的microRNAs, microRNA-103、microRNA-107、microRNA-1976。然后驗證這些小分子物質(zhì)是否通過調(diào)控靶基因的表達變化,影響心臟功能,為疾病的臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。二、方法1.老年竇房結(jié)功能減退患者血清microRNAs表達譜差異及靶基因預測收集老年竇房結(jié)功能減退患者與健康老人的血液。對血樣進行表達譜芯片分析,挑選差異性表達明顯的microRNAs。通過Miranda, mirbase, targetscan預測靶基因。2.熒光素酶報告系統(tǒng)證實老年竇房結(jié)功能減退患者異常升高的microRNAs靶向作用于竇房結(jié)起搏相關基因構(gòu)建microRNA表達質(zhì)粒,Luc-UTR報告基因,將質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)293T細胞。通過檢測luciferase活性,分析microRNA組與空白組熒光素酶活性的差異,判斷microRNA是否對目的基因3'UTR有作用,明確microRNA是否靶向作用于竇房結(jié)起搏相關靶基因。3.異常升高的microRNAs對人ips源性竇房結(jié)細胞中起搏相關離子通道蛋白CACNA1C、CACNA1D、CACNA1I、KCNQ1和KCNH2表達水平的影響通過標記HCN4的免疫熒光實驗,分析竇房結(jié)細胞百分比。通過顯微攝像技術(shù)留下質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)前后照片與視頻資料,統(tǒng)計分析心肌細胞瞬轉(zhuǎn)前后跳動節(jié)律變化,從功能上驗證microRNAs影響竇房結(jié)功能。收集細胞,實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(realtime PCR)技術(shù)和western blot方法,測定人ips源性竇房結(jié)細胞,瞬轉(zhuǎn)前后,鈣通道和鉀通道各：mRNA和蛋白表達水平變化,證明microRNAs通過調(diào)控起搏相關基因影響竇房結(jié)功能。三、結(jié)果1.老年竇房結(jié)功能減退患者血表達譜芯片分析與靶基因預測結(jié)果老年竇房結(jié)功能減退患者與健康老人血中,明顯差異性表達的microRNAs為microRN A-103、microRNA-107、microRNA-1976。通過靶基因預測軟件Miranda, mirbase, targetscan得到microRNA-103、microRNA-107的靶基因為KCNQ1和KCNH2, microRNA-1976的靶基因為CACNA1C、CACNAID. CACNA1I。2.老年竇房結(jié)功能減退異常升高的microRNAs的作用靶點通過顯著性檢驗(一般P0.05)確定存在結(jié)合位點(一般歸一化0.85)。Firefly結(jié)果與Renilla結(jié)果對比值：1976+ CACNA1I-U1為0.836885,1976+ CACNA1D-U1為0.903125,1976-CACNA1C-U1為0.740264,103a+KCNQ1-U1為0.693293,103a+KCNH2-U1為0.746934,107+KCNQ1-U1為0.820935, 107+KCNH2-U1為0.653819。3.人ips源性竇房結(jié)細胞株中竇房結(jié)細胞百分比經(jīng)統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)被標記細胞占細胞總量的10%-15%左右。4.人ips源性竇房結(jié)細胞microRNAs導入前后細胞跳動頻率變化將瞬轉(zhuǎn)后,培養(yǎng)72h的microRNAs組與對照質(zhì)粒組進行統(tǒng)計分析,在柱狀圖中可以清楚的看到兩者間存在顯著差異,瞬轉(zhuǎn)microRNA-103組的跳動頻率較對照質(zhì)粒組減慢。瞬轉(zhuǎn)microRNA-107組的跳動頻率較對照質(zhì)粒組減慢。瞬轉(zhuǎn)microRNA-1976組的跳動頻率較對照質(zhì)粒組約減慢。5.人ips源性竇房結(jié)細胞microRNAs導入前后鈣通道與鉀通道表達變化通過實時熒光定量PCR技術(shù),得到microRNAs的靶基因mRNA的表達水平的變化,microRNA-103、microRNA-107的靶基因mRNA (KCNH2、KCNQ1)均表達水平升高,而microRNA-1976使靶基因CACNA1C、CACNA1D的mRNA的表達水平降低,對于CACNA1I的作用不是太明顯。蛋白免疫印跡的結(jié)果表明,microRNA-103、microRNA-107使KCNH2、KCNQ1的蛋白上調(diào)表達,microRNA-1976使CACNA1C、CACNA1D與CACNA1I編碼的蛋白下調(diào)表達,其結(jié)果與RTPCR的結(jié)果一致。四、結(jié)論：1.通過我們的研究發(fā)現(xiàn)了老年竇房結(jié)功能減退患者血中差異性表達的microRNAs, microRNA-103、microRNA-107、microRNA-1976,提示其有望應用于疾病的診斷。2.驗證了差異性表達的microRNAs在起搏相關基因存在作用靶點。3.驗證microRNA-103、microRNA-107使人竇房結(jié)細胞中的KCNH2、 KCNQ1表達上調(diào),調(diào)節(jié)竇房結(jié)跳動節(jié)律的變化,而microRNA-1976通過下調(diào)鈣離子通道蛋白表達,調(diào)控竇房結(jié)的跳動節(jié)律。從細胞水平上驗證了microRNAs調(diào)控離子通道蛋白的表達變化,是老年竇房結(jié)電生理重塑導致功能減退的分子基礎。
【關鍵詞】：老年 竇房結(jié) microRNA 離子通道蛋白
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R541.7
【目錄】：

• 摘要6-10
• Abstract10-21
• 縮略詞21-23
• 第一部分 microRNA分子生物學特性及竇房結(jié)細胞電生理23-41
• 1.1 microRNAs概述23-30
• 1.1.1 microRNA生化23-24
• 1.1.2 microRNAs組織分布特異性24-27
• 1.1.3 microRNAs與心臟疾病27-30
• 1.2 心臟傳導系統(tǒng)30-38
• 1.2.1 心臟解剖基礎30-31
• 1.2.2 心臟傳導系統(tǒng)31-32
• 1.2.3 心肌細胞電生理32-37
• 1.2.4 竇房結(jié)的解剖與功能37-38
• 1.3 小結(jié)38-41
• 第二部分 老年竇房結(jié)功能減退患者血漿microRNAs表達譜差異及靶基因預測41-45
• 2.1 前言41
• 2.2 材料和方法41-42
• 2.3 結(jié)果42-45
• 第三部分 熒光素酶報告系統(tǒng)證實老年竇房結(jié)功能減退患者異常升高的microRNAs靶向作用于竇房結(jié)起搏相關基因45-49
• 3.1 前言45
• 3.2 材料和方法45-47
• 3.3 實驗結(jié)果47-49
• 第四部分 異常升高的microRNAs對人ips源性竇房結(jié)細胞中起搏相關離子通道蛋白CACNA1C、CACNA1D、CACNA11、KCNQ1和KCNH2表達水平的影響49-87
• 4.1 前言49
• 4.2 材料49-55
• 4.2.1 材料來源49-50
• 4.2.2 實驗試劑及主要配置方法50-54
• 4.2.3 主要儀器54-55
• 4.3 實驗方法55-71
• 4.3.1 質(zhì)粒提取55-57
• 4.3.2 細胞復蘇及支原體檢測57-60
• 4.3.3 瞬轉(zhuǎn)前細胞照片、視頻資料收集60
• 4.3.4 免疫熒光60-61
• 4.3.5 免疫熒光圖片信息采集61
• 4.3.6 質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)61-63
• 4.3.7 瞬轉(zhuǎn)后細胞照片、視頻資料收集63
• 4.3.8 RNA提取63-64
• 4.3.9 RNA濃度及RNA質(zhì)量測定64-65
• 4.3.10 cDNA的合成65-66
• 4.3.11 引物設計與合成由上海迅捷生物工程有限公司完成66-67
• 4.3.12 實時熒光定量PCR67-68
• 4.3.13 蛋白的免疫印跡分析68-71
• 4.4 實驗結(jié)果71-87
• 4.4.1 質(zhì)粒提取檢測結(jié)果71-72
• 4.4.2 支原體檢測結(jié)果72-73
• 4.4.3 細胞免疫熒光結(jié)果73-74
• 4.4.4 質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)心肌細胞結(jié)果74-77
• 4.4.5 質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)心肌細胞前,與質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)培養(yǎng)72h后,不同組別不同視野心肌細胞跳動節(jié)律變化統(tǒng)計77-82
• 4.4.6 RNA提取結(jié)果分析82-83
• 4.4.7 rtPCR結(jié)果分析83-85
• 4.4.8 蛋白免疫印跡結(jié)果分析85-87
• 第五部分 討論87-93
• 第六部分 展望93-94
• 致謝94-95
• 參考文獻95-108
• 碩士期間發(fā)表論文108

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