本文關(guān)鍵詞：AMPKα2在二甲雙胍抑制香煙暴露下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用

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【摘要】：背景:肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension,PH)作為慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的重要并發(fā)癥之一,直接影響了COPD患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。吸煙是COPD最主要的危險(xiǎn)因素,一系列臨床組織標(biāo)本和動(dòng)物模型結(jié)果表明:吸煙COPD患者的早期無低氧階段,甚至在肺功能完全正常的吸煙人群,肺血管重構(gòu)的現(xiàn)象就已經(jīng)開始出現(xiàn),其機(jī)制可能和吸煙致高氧化應(yīng)激狀態(tài)和慢性炎癥有關(guān)。近年來調(diào)控細(xì)胞能量代謝平衡的腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)作為調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要靶點(diǎn)備受關(guān)注。在糖尿病和肥胖患者中,其體內(nèi)AMPK低活性狀態(tài)與該類患者機(jī)體高氧化應(yīng)激狀態(tài)和慢性炎癥、心血管合并癥的發(fā)病率密切相關(guān)。AMPK的激活對于維持正常血管的正常結(jié)構(gòu)和功能十分重要。目前關(guān)于AMPK與體循環(huán)疾病,如動(dòng)脈粥樣硬化和球囊損傷后再狹窄的研究結(jié)果,幾乎得出了一致的結(jié)論——上調(diào)AMPK活性可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能,抑制動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。隨著對AMPK研究的深入,逐漸認(rèn)識(shí)到其關(guān)鍵亞型AMPKα1和AMPKα2,似乎在維持血管穩(wěn)態(tài)中所起的作用不盡相同。肺血管重構(gòu)是PH的基本病理特征,其中肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)表型轉(zhuǎn)化——從收縮型(分化)向合成型(未分化)轉(zhuǎn)化是獲得異常增殖/遷移、合成分泌能力,導(dǎo)致肺血管重構(gòu)和PH形成的前提和基礎(chǔ)。而香煙暴露下所致高氧化應(yīng)激和炎癥環(huán)境是COPD合并PH發(fā)生的基礎(chǔ),我們推測調(diào)控氧化應(yīng)激和慢性炎癥的靶點(diǎn)——AMPK極有可能在調(diào)控香煙暴露下PASMCs的表型轉(zhuǎn)化和增殖中發(fā)揮重要作用,有必要對其機(jī)制深入探討。傳統(tǒng)降糖藥物二甲雙胍是AMPK的激活劑,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明二甲雙胍抑制野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓形成,此項(xiàng)研究雖然未直接探討其機(jī)制,但初步證實(shí)了二甲雙胍可能對肺循環(huán)具有保護(hù)作用。本項(xiàng)目擬探討AMPK及其不同亞型在香煙暴露下PASMCs的表型轉(zhuǎn)化和過度增殖中的作用;闡明二甲雙胍是否通過激活A(yù)MPK或特定AMPK亞型抑制肺血管重構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)——PASMCs的表型轉(zhuǎn)化和過度增殖。在目前COPD相關(guān)肺動(dòng)脈高壓尚缺乏有效治療手段的背景下,一旦我們的假設(shè)得以驗(yàn)證,將有助于闡明吸煙致COPD相關(guān)PH的分子機(jī)制,并為其早期防治提供新思路。研究目的:1.研究吸煙、全身炎癥水平與PH之間的關(guān)系;2.明確AMPKα2在香煙提取物(cigarette smoking extract,CSE)誘導(dǎo)的大鼠PASMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用。3.明確AMPKα2在二甲雙胍抑制香煙暴露下PASMCs表型轉(zhuǎn)化和增殖中的作用。研究方法:1.采用病例對照研究設(shè)計(jì),以2013年4月-2015年3月111例入住我科的COPD合并PH患者作為病例組,匹配年齡、性別后以同期111例COPD未合并PH的住院患者作為對照組。采集患者年齡、性別、吸煙史、血沉(ESR)、白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比例(NLR)、血清C-反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、纖維蛋白原(FIB)、降鈣素原(PCT)、動(dòng)脈血?dú)�、胸部CT及心臟彩超等結(jié)果。使用SPSS 22軟件對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較,并進(jìn)行相關(guān)性分析及多因素Logistic回歸分析找出PH的相關(guān)危險(xiǎn)因素;2.5%CSE處理體外分離培養(yǎng)大鼠PASMCs,采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖,Western blot檢測PASMCs表型標(biāo)志物(SMA),AMPK、m TOR表達(dá)及其磷酸化水平。采用慢病毒介導(dǎo)的si RNA沉默PASMCs中AMPKα1和AMPKα2基因表達(dá),明確不同亞型AMPKα在CSE誘導(dǎo)的PASMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用;3.觀察二甲雙胍對5%CSE暴露下PASMCs表型轉(zhuǎn)化和增殖的影響,明確AMPKα2是否在其中起關(guān)鍵作用。研究結(jié)果:1.COPD合并PH組的吸煙指數(shù)、血清CRP、IL-6及TNF-α水平均明顯高于COPD未合并PH組(p0.05);2.吸煙指數(shù)、血清CRP、IL-6及TNF-α水平與肺動(dòng)脈收縮壓呈正相關(guān)(p0.05),吸煙指數(shù)與CRP水平也呈正相關(guān)(p0.05);3.多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示吸煙指數(shù)、血清CRP、IL-6及TNF-α水平是肺動(dòng)脈高壓形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR值分別為6.185、6.740、3.434、2.700,p0.05);4.CCK-8結(jié)果顯示5%CSE促進(jìn)大鼠PASMCs增殖,Western blot結(jié)果顯示5%CSE可以下調(diào)PASMCs收縮表型標(biāo)志物SMA的表達(dá)(p0.05);5.采用慢病毒介導(dǎo)的si RNA技術(shù)成功將大鼠PASMCs中的AMPKα1、AMPKα2基因沉默后,Western blot結(jié)果顯示AMPKα2 si RNA組的SMA表達(dá)明顯下降(p0.05);6.CCK-8結(jié)果顯示二甲雙胍明顯抑制5%CSE促PASMCs的增殖效應(yīng)(p0.05);二甲雙胍無法抑制AMPKα1 si RNA組和AMPKα2 si RNA組PASMCs的增殖;7.Western blot結(jié)果顯示二甲雙胍可以逆轉(zhuǎn)5%CSE誘導(dǎo)的SMA表達(dá)下調(diào)(p0.05);8.Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)二甲雙胍通過激活A(yù)MPKα2/m TOR途徑抑制5%CSE致PASMCs表型轉(zhuǎn)化,維持PASMCs正常表型。研究結(jié)論:1.吸煙、全身炎癥反應(yīng)(CRP、IL-6、TNF-α水平增加)是肺動(dòng)脈高壓發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;2.吸煙及血清CRP、IL-6、TNF-α與肺動(dòng)脈收縮壓呈正相關(guān),吸煙指數(shù)與血清CRP呈正相關(guān);3.體外實(shí)驗(yàn)證明5%CSE促進(jìn)大鼠PASMCs增殖,并下調(diào)PASMCs收縮表型標(biāo)志物SMA的表達(dá),使PASMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化;4.AMPKα2在CSE誘導(dǎo)的PASMCs表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用;5.二甲雙胍可以逆轉(zhuǎn)5%CSE誘導(dǎo)的SMA表達(dá)下調(diào),從而維持PASMCs正常表型,抑制其過度增殖,其機(jī)制依賴于AMPKα2的活化。
【關(guān)鍵詞】：肺動(dòng)脈高壓 慢性阻塞性肺疾病 炎癥 香煙 二甲雙胍 AMPKα2 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 表型轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R544.1;R563.9
【目錄】：

• 縮略詞表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 吸煙及全身炎癥反應(yīng)與慢性阻塞性肺疾病患者中發(fā)生肺動(dòng)脈高壓的相關(guān)性研究15-22
• 2.1 對象與方法15-16
• 2.2 結(jié)果16-19
• 2.3 討論19-21
• 2.4 小結(jié)21-22
• 第三章 AMPKα2在香煙提取物促進(jìn)大鼠PASMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用22-53
• 3.1 材料和方法23-36
• 3.2 結(jié)果36-51
• 3.3 討論51-52
• 3.4 小結(jié)52-53
• 第四章 二甲雙胍通過AMPKα2抑制香煙提取物誘導(dǎo)的大鼠PASMCs表型轉(zhuǎn)化53-65
• 4.1 材料和方法53-56
• 4.2 結(jié)果56-63
• 4.3 討論63-64
• 4.4 小結(jié)64-65
• 全文結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-69
• 文獻(xiàn)綜述 慢性炎癥在肺動(dòng)脈高壓發(fā)生中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展69-80
• 參考文獻(xiàn)74-80
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文80-81
• 致謝81

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