本文關鍵詞：吲哚胺2,3雙加氧酶調節(jié)血管平滑肌細胞表型轉換的體外研究

  更多相關文章： 低色氨酸 犬尿氨酸 吲哚氨2 3雙加氧酶 血管平滑肌細胞 增值表型轉換

【摘要】：目的：為探索吲哚胺2,3雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)及其代謝微環(huán)境(低色氨酸及色氨酸代謝產物堆積)在動脈硬化閉塞癥(atherosclerotic occlusive, ASO)、經皮動脈腔內血管成形術(percutaneous transluminal angioplasty, PTA)及支架植入術后再狹窄(restenosis, RS)等病理過程中的作用,本實驗研究其體外對血管平滑肌細胞(Vascular Smooth Muscular Cell, VSMC)增殖及表型轉換的影響。方法：采用血管環(huán)翻轉貼壁法原代培養(yǎng)小鼠主動脈平滑肌細胞(SMCs),并對其進行平滑肌α-肌動蛋白(SM α-actin)免疫細胞化學法(immunocyto-chemistry, ICC)鑒定；應用低色氨酸(Low-tryptophan, L-Trp)及其代謝產物犬尿氨酸(Kynurenine, KYN)培養(yǎng)并觀察對其增殖能力及表型基因表達的影響；通過與高表達IDO的小鼠血管瘤內皮細胞(EOMA, ATCC(?) CRL-2586TM)聯(lián)合培養(yǎng),利用MTT法檢測其增殖情況,并應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantified real time PCR, qRT-PCR)檢測其表型基因的表達水平上的差異。使用SPSS 19.0軟件包進行數(shù)據分析。結果：經上述方法體外培養(yǎng)主動脈SMCs,5-10天可有細胞萌出,每取材2只小鼠可獲得約6×105個二代SMCs,傳至第三代時細胞生長呈典型的“峰”和“谷”形態(tài),經SM α-actin免疫組化鑒定呈陽性(棕色),細胞純度達95%以上。3-10代細胞增殖旺盛,形態(tài)典型,細胞傳代至10-12代以后細胞形態(tài)變化較大,生長緩慢,凋亡增多。取3-5代SMCs用于后續(xù)實驗。L-Trp可以較為明顯抑制SMCs的增殖,但其代謝產物KYN則只有在高濃度下才會對SMCs的增殖產生抑制作用,而且這種抑制作用在培養(yǎng)96小時后才會表現(xiàn)出來,qRT-PCR顯示：在120小時的培養(yǎng)時間內,無論是L-Trp還是KYN培養(yǎng)均未對SMCs收縮表型基因Smoothelin-B的表達產生顯著影響,單純KYN (200 μM)培養(yǎng)對合成表型基因Syndecan-1的表達亦未產生明顯影響,而只有L-Trp (10μM)及L-Trp+KYN聯(lián)合培養(yǎng)組在培養(yǎng)72h、96h、120h時Syndecan-1的表達顯著下調�？紤]可能是單純色氨酸饑餓環(huán)境產生的影響,而代謝產物KYN (200 μM)并不能顯著影響此兩種表型基因的表達。SMCs與高表達小鼠IDO的EOMA共培養(yǎng)后96h、120h后,SMCs的增殖受到抑制,而添加IDO特異性抑制劑1-mT(1-methyl tryptophan,1-甲基色氨酸)后這種抑制作用消失,提示IDO對SMCs的增殖產生抑制作用。qRT-PCR結果提示平滑肌細胞Smoothelin-B在與EOMAIDO+共培養(yǎng)96h、120h后表達顯著上調,Syndecan-1則在共培養(yǎng)120h后表達下調,添加1-mT后這種效應被削弱。結論：采用改良的血管環(huán)翻轉貼壁法能獲得高純度的SMCs,簡單易行,且有效避免了外膜成纖維細胞及內膜內皮細胞的污染�？蔀閷嶒炑芯刻峁┘毎牧稀５蜕彼�(10μM)可抑制平滑肌細胞的增殖,而其代謝產物KYN只有在高濃度(200μ M)下才產生這種抑制作用,不認為兩者對SMCs的表型轉換有明顯影響。IDO可抑制SMCs的增殖及去分化,促進SMCs向收縮型轉換,尚不能認為這種效應由色氨酸饑餓及其代謝產物聚集所引起,可能存在其他作用機制尚待研究。
【關鍵詞】：低色氨酸 犬尿氨酸 吲哚氨2 3雙加氧酶 血管平滑肌細胞 增值表型轉換
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 符號說明10-11
• 前言11-15
• 研究現(xiàn)狀、成果11-12
• 研究目的、方法12-14
• 實驗流程圖14-15
• 一、原代培養(yǎng)小鼠主動脈平滑肌細胞15-26
• 1.1 實驗對象和方法15-19
• 1.1.1 實驗動物15
• 1.1.2 主要試驗儀器15
• 1.1.3 主要試劑15-16
• 1.1.4 原代培養(yǎng)小鼠血管平滑肌細胞16-17
• 1.1.5 細胞消化傳代及純化17
• 1.1.6 免疫組化鑒定及細胞純度17-18
• 1.1.7 細胞計數(shù)及活力檢測18
• 1.1.8 細胞凍存與復蘇18-19
• 1.1.9 生長曲線19
• 1.2 結果19-20
• 1.2.1 細胞形態(tài)學觀察19-20
• 1.2.2 傳代及活力20
• 1.2.3 生長曲線20
• 1.2.4 免疫組化20
• 1.3 討論20-22
• 1.4 小結22-23
• 附圖23-26
• 二、體外IDO對平滑肌細胞增殖及表型轉換的影響26-47
• 2.1 對象和方法26-39
• 2.1.1 實驗材料與儀器26-27
• 2.1.2 L-TRP及其代謝產物KYN培養(yǎng)SMCs27-28
• 2.1.3 高表達IDO的EOMA對SMCs的影響28-33
• 2.1.4 MTT檢測SMCs增殖33
• 2.1.5 qRT-PCR檢測其表型基因表達33-38
• 2.1.6 統(tǒng)計學分析數(shù)據38-39
• 2.2 結果39-44
• 2.2.1 MTT檢測VSMC增殖情況39-40
• 2.2.2 qRT-PCR檢測其表型基因表達40-44
• 2.3 討論44-46
• 2.4 小結46-47
• 結論47-48
• 參考文獻48-51
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明51-52
• 附錄52-59
• 綜述59-73
• 參考文獻68-73
• 致謝73

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前2條

1 李永光;朱偉;陸志剛;魏盟;;STAT3在血管平滑肌細胞中的作用及其機制的最新進展[J];上海醫(yī)學;2014年07期

2 韓博;徐三榮;張進;周慶;李偉;;同基因與異基因胚胎肝干細胞移植治療小鼠肝硬化[J];中國組織工程研究;2013年36期

中國博士學位論文全文數(shù)據庫 前1條

1 張沛;SOCS3在心臟移植慢性排斥反應中的作用和機制研究[D];華中科技大學;2014年

中國碩士學位論文全文數(shù)據庫 前3條

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2 呂慧彥;外周血中S100A4蛋白水平與肺腺癌、肺鱗癌的相關性分析[D];大連醫(yī)科大學;2014年

3 朱麗娟;食管鱗狀細胞癌組織中S100A11、14-3-3、Gstp和HnRNPA2/B1的表達及其臨床意義的研究[D];新疆醫(yī)科大學;2014年

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本文編號：639724