本文關鍵詞：治療性低溫對缺氧期心肌細胞自噬流的影響及機制研究

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【摘要】：研究背景隨著國民生活方式的改變,我國冠心病的發(fā)病率正逐年攀升并呈年輕化趨勢。而急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)是冠心病中最為兇險的類型,每年在中國大約350萬人由于心血管疾病而死亡,是各種疾病中死亡率最高的疾病之一,其中有半數(shù)以上的人死于心肌梗死,甚至猝死。因此及時提出有效防治AMI的措施和手段將刻不容緩。治療性低溫(Therapeutic Hypothermia, TH)是經(jīng)物理方法降低細胞代謝速率,將患者體溫降至預期水平(32℃左右)從而治療疾病的新方法。近年來,國外率先采用TH治療腦卒中等腦血管疾病,并取得令人矚目的成果。但TH在心血管病治療領域仍處在早期研究階段,TH療法對心肌缺氧損傷的作用及其機制研究鮮有報道。心肌缺氧期間,由于細胞能量生成減少,細胞內酸中毒,使溶酶體膜穩(wěn)定性降低,導致細胞損傷；TH能有效調節(jié)減慢能量代謝,穩(wěn)定細胞內酶活性,保護缺氧損傷細胞；自噬(Autophagy)往往在營養(yǎng)缺乏等應激條件下被進一步激活,自噬表達上調,從而增加心肌對缺血缺氧的耐受性,但是過度自噬又會促進細胞死亡,稱為自噬性細胞死亡。現(xiàn)有部分研究表明：TH能在缺氧期間保護器官功能并改善細胞活性,但在缺氧期間TH對自噬的影響以及相關的機制未見文獻報道。本課題為了探討TH在心肌缺氧期間對自噬表達的影響以及調控自噬的相關機制,以H9c2大鼠心肌細胞株作為實驗對象,將H9c2心肌細胞置于含95%氮氣等混合氣體的缺氧盒中模擬缺氧,磷酸鹽緩沖液(PBS)代替培養(yǎng)基模擬缺血。先通過對比不同缺氧時間中TH對自噬表達的影響,再對比單純缺氧與TH處理在應用雷帕霉素后磷酸化mTOR、 S6等mTOR相關通路下游效應蛋白的表達差異,明確TH對自噬的影響及其機制。目的為了探討治療性低溫(TH)在缺血期對心肌細胞自噬及自噬流的影響,并探討相關機制。方法使用大鼠心肌細胞株H9c2,置于含95%氮氣等混合氣體的缺氧盒模擬缺氧,PBS代替完全培養(yǎng)基模擬缺血。第一部分實驗：在不同缺氧時間中,單純缺氧與TH處理后的細胞狀態(tài)及活性的差異：實驗分組：1)空白對照組(Control) 2)單純缺氧組(Hypoxia)3)TH處理缺氧組(TH),分別置于缺氧盒中模擬缺氧1 h、2 h、3 h,采用光學顯微鏡評估細胞狀態(tài),臺盼藍拒染實驗判斷活性情況。第二部分實驗：進一步探討TH組與單純缺氧組缺氧1-3 h的自噬水平及3h自噬流表達水平的差異：實驗分組：1)空白對照組(Control) 2)單純缺氧組(Hypoxia)3) TH處理缺氧組(TH),置于缺氧盒中模擬缺氧1-3 h,免疫印跡法(Western Blot)觀察自噬相關蛋白自噬微管相關蛋白輕鏈3B (LC3B)、 p62、 Beclin-1,最后用透射電子顯微鏡觀察缺氧3h各組自噬泡形成,腺病毒GFP-mRFP-LC3熒光瞬時轉染技術明確自噬流表達水平。通過藥物干預自噬水平,觀察TH在缺氧心肌細胞中的作用,實驗分組：1)單純缺氧組(Hypoxia)2) TH處理缺氧組(Hypoxia+TH) 3) 3甲基腺嘌呤干預單純缺氧組(Hypoxia+3-MA) 4) 3甲基腺嘌呤干預TH處理缺氧組(Hypoxia +TH+3-MA)5)雷帕霉素干預單純缺氧組(Hypoxia+rapamycin) 6)雷帕霉素干預TH處理缺氧組(Hypoxia+TH+rapamycin),3-MA (10 mM)、雷帕霉素(0.1 μM)相關組造模前2h給藥,同時放入缺氧盒中模擬缺氧,免疫印跡法(Western Blot)檢測自噬相關蛋白LC3B, p62的表達情況,臺盼藍拒染實驗檢測細胞活性。第三部分實驗：進一步應用雷帕霉素預處理觀察缺氧期TH影響自噬表達水平中在mTOR信號通路的相關機制,實驗分組：1)單純缺氧組(Hypoxia)2)TH處理缺氧組(TH)3)雷帕霉素干預單純缺氧組(Hypoxia+raparaycin) 4)雷帕霉素干預TH處理缺氧組(TH+raparaycin),雷帕霉素(0.1μM)相關組造模前2小時給藥,同時放入缺氧盒中模擬缺氧,免疫印跡法(Western Blot)檢測自噬相關蛋白LC3B, p62,以及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路相關蛋白磷酸化mTOR、核糖體蛋白S6(S6)的表達情況。統(tǒng)計學分析：采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,組間差別統(tǒng)計采用單因素方差分析比較,各組均數(shù)間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。實驗均獨立重復3次。研究結果1、在不同缺氧時間中,單純缺氧與TH處理后細胞狀態(tài)差異：在光學顯微鏡下,隨著缺氧時間的延長,越來越多的細胞發(fā)生皺縮,變圓,與缺氧組相比,TH處理的細胞在缺氧3h細胞形態(tài)明顯改善(圖1-1)；臺盼藍拒染實驗結果也表明,隨著缺氧時間的延長,細胞活性明顯下降,而TH能有效減少細胞死亡(圖1-2)。2、進一步探討TH組與單純缺氧組缺氧3h后自噬活性和自噬流表達水平的差異：缺氧刺激后,免疫印跡法(Western Blot)檢測自噬相關蛋白,顯示隨著缺氧時間延長(缺血1、2、3 h),單純缺氧組與對照組相比LC-3B表達顯著增高(p0.01)(圖2-1.B),p62表達也相應顯著降低(p0.01)(圖2-1.C)；其中缺氧處理2h和3h的時候,而單純缺氧組與TH處理組相比LC-3B表達顯著增高(2小時p0.05,3小時p0.01),p62表達也相應顯著降低(p0.01)；但Beclin-1的表達水平在缺氧3h處理后單純缺氧組與對照組相比顯著增高(p0.01),但單純缺氧組和TH處理組之間并無統(tǒng)計學差異(圖2-1,D)。為了明確在缺氧3h時TH對自噬小體形成以及自噬流的影響,應用透射電子顯微鏡觀察,對照組、單純缺氧組、TH組中自噬小體分別是：2.33±1.53(個/HPF),7.00±1.00(個/HPF),3.67±1.15(個/HPF),統(tǒng)計結果表明單純缺氧組明顯高于對照組(p0.01),也明顯高于TH組(p0.05),TH組與對照組無統(tǒng)計學差異(圖2-2)。表明缺氧損傷能大量促進自噬小體形成,TH能部分減少缺氧損傷后的自噬小體。自噬流,即自噬小體的產(chǎn)生與消逝的動態(tài)過程,被認為是更為科學地評價自噬水平的方式,我們進一步探討TH在缺氧下對自噬流調控情況。我們應用腺病毒GFP-mRFP-LC3瞬時轉染細胞,觀察到缺氧3h后,對照組、單純缺氧組、TH組中的GFP(點/單個細胞)分別是：4.33±2.52,63.00±9.17,31.00±11.14；mRFP(點/單個細胞)分別是8.33±5.13,139.00±14.11,43.67±18.93。統(tǒng)計結果表明在GFP和mRFP中單純缺氧組均明顯高于對照組和TH組(p0.01),TH組與對照組無統(tǒng)計學差異,即黃點(GFP與mRFP融合的部分)中單純缺氧組均明顯高于對照組和TH組(p0.01),TH組與對照組無統(tǒng)計學差異(圖2-3)。上述結果表明,缺氧能顯著促進自噬流,而TH處理能減少缺氧引起的自噬小體以及自噬溶酶體的形成,從而抑制自噬流。通過藥物干預自噬活性水平,驗證TH在缺氧心肌細胞中的作用及相關機制：應用3-MA及雷帕霉素干預缺血期心肌細胞自噬,觀察TH對缺氧心肌自噬對細胞活性的調控作用。作為PI3K抑制劑,3-MA被認為是有效抑制自噬的工具藥,通過抑制自噬早期階段自噬小體形成,從而減少自噬小體及其重要組成部分LC-3B的表達抑制自噬。免疫組化結果表明,經(jīng)過3-MA(10mM)預處理2h后(1組與3組相比,2組與4組相比),LC-3B表達減少,且p62的表達增加(圖2-4.A,B,C)。而臺盼藍拒染實驗結果表明缺氧3小時后,3-MA進一步加重心肌細胞損傷,表明缺氧期減少自噬水平對細胞活性并未獲益(圖2-4.D)。與此同時,4組較3組細胞活性更低,表明一定水平的自噬有助于保護缺氧期間的心肌細胞。雷帕霉素通過抑制mTOR蛋白有效激活自噬被普遍應用于體內外自噬相關實驗中,免疫印跡實驗結果表明,經(jīng)過雷帕霉素(0.1μM)預處理2 h后(1組與5組相比,2組與6組相比),LC-3B表達增加,且p62的表達減少(圖2-4.E,F,G)。細胞活性結果表明缺氧3h后,雷帕霉素減輕心肌細胞損傷,表明缺氧期間TH保護心肌細胞不僅僅通過對自噬水平的調節(jié),還存在其他細胞保護機制(圖2-4.H)。3、雷帕霉素預處理觀察缺氧期TH影響自噬表達水平中在mTOR信號通路的相關機制：mTOR被認為是在哺乳動物細胞中負向調控自噬的關鍵蛋白。核糖體蛋白S6(S6)是mTOR下游的效應蛋白,磷酸化S6被認為是mTOR激活程度重要標記蛋白。因此,我們檢測了各組mTOR和S6的磷酸化程度。缺氧刺激后,應用免疫印跡法檢測自噬相關蛋白,單純缺氧組與對照組相比磷酸化mTOR、 S6的顯著減少(p0.01)；而TH處理組與單純缺氧組相比磷酸化mTOR和S6蛋白表達顯著增多(p0.01),表明TH處理能部分恢復缺氧后被抑制的mTOR通路相關蛋白中的磷酸化mTOR. S6。雷帕霉素是自噬激動劑,同時也是mTOR蛋白的抑制劑,為了驗證mTOR通路在TH干預缺氧引起的自噬過程中的作用,我們應用雷帕霉素預處理2 h,western blot法檢測自噬相關蛋白,雷帕霉素預處理后的兩組與雷帕霉素未處理的兩組(即3組與1組相比；4組與2組相比)相比顯示LC-3B表達增高(p0.05),p62表達也相應顯著降低(p0.01),表明雷帕霉素能有效上調兩組的自噬活性水平(圖3-1.B,C)；然而,雷帕霉素無法進一步降低單純缺氧后(1組與3組)的磷酸化mTOR和S6蛋白表達水平(p0.05),卻可以抑制TH處理后(2組與4組)的磷酸化mTOR和S6蛋白表達水平(p0.05)(圖3-1.D,E),雷帕霉素處理后的缺氧組與該藥處理后的TH組(3組與4組)相比,磷酸化的mTOR和S6并無統(tǒng)計學差異(p0.05),表明雷帕霉素處理后能充分抑制mTOR下游信號通路�？偠灾�,雷帕霉素處理后的兩組自噬相關蛋白表達水平明顯升高,表明雷帕霉素能促進缺氧組和TH組的自噬表達水平,且mTOR通路下游相關蛋白表達減少,表明在缺氧期TH能有效激活mTOR通路,且部分通過mTOR通路下調自噬水平。結論1、本研究通過建立誘導H9c2大鼠心肌細胞株缺氧損傷模擬心肌缺血,缺氧3 h后可明顯造成H9c2心肌細胞損傷,表明心肌缺氧損傷模型構建成功,且TH能有效減輕心肌細胞缺氧損傷,為進一步探討TH對缺氧心肌的自噬水平的影響及相關機制研究提供了研究基礎。2、本研究通過缺氧處理H9c2心肌細胞模擬心肌缺血損傷,TH處理干預細胞損傷,檢測自噬及自噬流水平,表明TH部分抑制缺氧上調的自噬及自噬流。并進一步應用自噬抑制劑3-甲基腺苷酸、自噬激動劑雷帕霉素預處理后再缺氧處理H9c2心肌細胞模擬的心肌缺血損傷,明確TH在缺氧心肌細胞中的作用：(1)一定水平的自噬對維持細胞活性至關重要；(2)缺氧期間TH保護心肌細胞不僅僅通過對自噬水平的調節(jié),還存在其他細胞保護機制。3、本研究通過應用自噬激動劑雷帕霉素預處理后再缺氧處理H9c2心肌細胞模擬的心肌缺血損傷,探討TH在缺氧心肌細胞中對自噬調控的相關機制,明確了：TH能有效激活缺氧期mTOR通路,且部分通過mTOR通路下調自噬水平。
【關鍵詞】：治療性低溫 自噬流 mTOR H9c2細胞 缺氧損傷
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 H9c2心肌細胞株的培養(yǎng)和缺氧模型建立18-28
• 1.1 研究背景18-19
• 1.2 方法19-24
• 1.3 結果24-26
• 1.4 討論26-28
• 第二章 治療性低溫對自噬活性及自噬流水平的影響及作用28-54
• 2.1 研究背景28-30
• 2.2 方法30-42
• 2.3 結果42-49
• 2.4 討論49-54
• 第三章 治療性低溫下調缺氧后自噬活性的mTOR信號通路相關機制研究54-61
• 3.1 研究背景54-55
• 3.2 方法55-56
• 3.3 結果56-59
• 3.4 討論59-61
• 全文總結61-62
• 參考文獻62-69
• 攻讀學位期間成果69-70
• 致謝70-72

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本文編號：600546