本文關鍵詞：雷公藤對ITP患者T細胞亞群IDO與TTS表達的影響

  更多相關文章： 雷公藤 免疫性血小板減少性紫癜 吲哚胺2 3-雙加氧酶 色氨酰-tRNA合成酶

【摘要】：背景：免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenia,ITP)是由于自身反應性T和B淋巴細胞被血小板自身抗體激活,機體發(fā)生一系列免疫反應,導致體內血小板生成減少,破壞增多的自身免疫性疾病。ITP患者具有皮下粘膜出血、骨髓巨核細胞增多等臨床特點,嚴重者還會導致內臟出血。雷公藤(Tripterygium wilfordii,TW)具有免疫抑制效應,是臨床常用的治療自身免疫性疾病的一味具有抗炎、免疫抑制效應的中藥。吲哚胺2,3-雙加氧酶(Indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)通過介導色氨酸沿犬尿氨酸的代謝途徑來誘導和維持機體的外周免疫耐受。而色氨酰-tRNA合成酶(Tryptophanyl-tRNAsynthetase,TTS)則是通過將色氨酸加載到它特異的tRNA上,形成蛋白復合物拮抗IDO對色氨酸的消耗參與機體免疫反應。本研究通過觀察臨床ITP患者使用雷公藤治療的療效,同時檢測ITP患者雷公藤治療前后T細胞中IDO與TTS表達的情況,了解雷公藤對ITP患者IDO/TTS介導的色氨酸代謝途徑的影響。目的：1.觀察ITP患者使用雷公藤的療效；2.檢測雷公藤使用前后,ITP患者T細胞中IDO與TTS表達的變化情況,了解雷公藤對ITP患者IDO/TTS介導的色氨酸代謝途徑的影響；3.通過檢測雷公藤與地塞米松分別刺激ITP患者PBMCs細胞后,患者T細胞IDO與TTS表達的變化情況,進一步驗證雷公藤、地塞米松對ITP患者IDO/TTS介導的色氨酸代謝途徑的影響。方法：1.研究對象的納入：臨床收治初診或復發(fā)的ITP患者25例,排除糖尿病、結核、肝炎、消化道潰瘍、高血壓等疾病。抽血前至少30天未使用免疫抑制劑治療。納入對象均采用雷公藤多甙片每日按每千克體重1-1.5mg的劑量進行治療。在治療前及治療后第5天抽取患者肝素抗凝全血標本。選取健康人25例為正常對照組,均不做任何治療處理。2.單個核細胞的分離與培養(yǎng)：采集患者和健康對照人群的肝素抗凝血標本l0ml,用淋巴細胞分離液梯度分離單個核細胞,吸取中間白膜層細胞,用PBS洗滌兩次后,調整細胞濃度至5×106/ml,用配制好的改良型1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng),并分別用2nM的雷公藤溶液和luM的地塞米松溶液與單個核細胞共同培養(yǎng)12個小時。3.流式細胞術(FCM)檢測PBMCs壞死率：收集培養(yǎng)12小時后的細胞,將細胞濃度調整為5×105個/ml。每管加碘化丙啶(Propidium,PI)5ul,室溫避光孵育15min后上機檢測。4.檢測IDO與TTS的表達：表染CD4、CD8抗體,破膜后胞內染IDO與TTS抗體后,上機檢測CD4+與CD8+細胞中IDO與TTS表達的變化情況。同時用RT-PCR檢測IDO、 TTS mRNA的表達。結果：1.雷公藤治療ITP患者臨床有效率為80%。2.FCM檢測雷公藤治療前后ITP患者T細胞中IDO與TTS的表達結果：與正常對照組相比,ITP患者CD4+與CD8+細胞中IDO的表達量降低,而TTS的表達量則明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。有效組治療后,患者CD4+與CD8+細胞中IDO的表達量與治療前相比明顯上升,TTS的表達量則明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。但在治療無效組中,患者CD4+與CD8+細胞中IDO與TTS的表達量與治療前相比均無明顯差異(P0.05)。3.RT-PCR檢測雷公藤治療前后IDO和TTS mRNA的表達結果：有效組治療前PBMCs的IDO mRNA的表達量較正常對照組低,而TTS mRNA表達量較正常對照組高,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。雷公藤治療后,PBMCs中IDO的表達量比治療前增高,TTS的表達量減低,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.PI檢測PBMCs壞死率：正常對照組、病人空白對照組、溶劑對照組、雷公藤處理組、地塞米松處理組中PBMCs壞死率分別為：0.70%、0.46%、0.70%、0.94%、0.79%。所測孔中PBMCs壞死率均1%。5.FCM檢測藥物刺激后T細胞中IDO和TTS的表達結果：ITP患者空白對照CD4+與CD8+細胞中IDO的表達量與正常對照組相比降低,TTS表達量增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。雷公藤處理后的患者CD4+與CD8+細胞中IDO的表達量較患者空白對照中CD4+與CD8+細胞中IDO的表達量增高,TTS的表達量降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。地塞米松處理后患者CD4+與CD8+細胞中IDO的表達量較患者空白對照增高,TTS的表達量減低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。溶劑對照組與病人空白對照組之間、雷公藤處理組與地塞米松處理組之間CD4+與CD8+細胞中IDO與TTS的表達量無明顯變化(P0.05)。6. RT-PCR檢測藥物作用后PBMCs中IDO和TTS的mRNA表達結果：ITP患者空白對照的PBMCs中IDO mRNA表達與正常對照相比減低,TTS表達量增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。雷公藤處理后患者PBMCs中IDO mRNA表達較患者空白對照增高,TTS的表達量下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。地塞米松處理后PBMCs中IDO mRNA表達較患者空白對照增加,TTS的表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。溶劑對照組與病人空白對照組之間、雷公藤處理組與地塞米松處理組之間IDO與TTS的mRNA表達無明顯變化(P0.05)。結論：雷公藤對提升ITP患者的血小板有明顯療效,與地塞米松相似,也是通過IDO/TTS介導的色氨酸代謝途徑發(fā)揮作用。臨床有望使用雷公藤替代糖皮質激素對ITP患者進行治療,以避免患者因便用糖皮質激素而出現(xiàn)的小良反應。
【關鍵詞】：雷公藤 免疫性血小板減少性紫癜 吲哚胺2 3-雙加氧酶 色氨酰-tRNA合成酶
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R558.2
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-11
• 引言11-15
• 第一章 雷公藤多甙片治療ITP患者的臨床療效研究15-18
• 1.1 材料與方法15-16
• 1.1.1 研究對象15
• 1.1.2 治療方法15
• 1.1.3 療效判定標準15-16
• 1.2 結果16
• 1.3 討論16-18
• 第二章 雷公藤對ITP患者IDO、TTS的影響18-30
• 2.1 材料18-20
• 2.1.1 研究對象18
• 2.1.2 主要試劑和耗材18-19
• 2.1.3 主要儀器19-20
• 2.1.4 主要溶劑的配制20
• 2.2 實驗方法20-23
• 2.2.1 分離患者PBMCs20-21
• 2.2.2 流式細胞術檢測T細胞亞群上IDO和TTS的表達21
• 2.2.3 RT-PCR檢測單個核細胞中IDO和TTS mRNA的表達21-23
• 2.3 統(tǒng)計學分析23
• 2.4 實驗結果23-27
• 2.4.1 流式細胞術檢測雷公藤治療前后患者T細胞上IDO與TTS的表達結果23-26
• 2.4.2 RT-PCR檢測單個核細胞中IDO和TTS mRNA的表達結果26-27
• 2.5 討論27-30
• 第三章 雷公藤、地塞米松刺激對ITP患者IDO、TTS表達的影響30-43
• 3.1 材料30-32
• 3.1.1 研究對象30
• 3.1.2 主要試劑和耗材30-31
• 3.1.3 主要儀器31-32
• 3.1.4 主要溶劑的配制32
• 3.2 實驗方法32-36
• 3.2.1 分離患者PBMCs32-33
• 3.2.2 藥物與PEMCs共培養(yǎng)33
• 3.2.3 單染PI檢測藥物作用后PBMCs的壞死情況33-34
• 3.2.4 流式細胞術檢測T細胞亞群上IDO和TTS的表達34
• 3.2.5 RT-PCR檢測單個核細胞中IDO和TTS mRNA的表達34-36
• 3.3 統(tǒng)計學分析36
• 3.4 實驗結果36-41
• 3.4.1 藥物作用后PBMCs的壞死率36-37
• 3.4.2 藥物作用后T細胞上IDO與TTS的表達37-40
• 3.4.3 PCR檢測單個核細胞中IDO和TTS基因水平的表達結果40-41
• 3.5 討論41-43
• 結語43-44
• 參考文獻44-47
• 附錄47-55
• 附錄1 ：綜述47-53
• 參考文獻50-53
• 附錄253-54
• 附錄354-55
• 在校期間發(fā)表論文情況55-56
• 致謝56

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