本文關鍵詞：hAIF-1重組腺病毒對A549細胞增殖和遷移的影響

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【摘要】：AIF-1是一個大小為17kDa,位于細胞質中的鈣離子結合蛋白,包含2個EF-手形結構域,能夠結合并聚合肌動蛋白,在自然界中AIF-1的豐度不高,所以想要分離得到大量天然的表達產物困難較大。已有研究證實AIF-1能夠促進血管平滑肌細胞、內皮細胞、巨噬細胞以及乳腺癌細胞等多種細胞的增殖和遷移,進而影響相關疾病的發(fā)生和發(fā)展,AIF-1與細胞分化之間關系的研究較少發(fā)現(xiàn)。本實驗將人AIF-1cDNA克隆到原核表達載體,并用IPTG進行誘導表達,純化AIF-1原核表達蛋白,初步研究AIF-1對人肺細胞株A549增殖和遷移的影響,并首次探討了AIF-1與小鼠成肌細胞C2C12分化的相關性。依據(jù)人AIF-1基因序列,設計引物,將人AIF-1 cDNA克隆到pET-28a(+)載體,構建pET-28a(+)-hAIF-1原核表達載體,轉化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細菌誘導表達,收集菌體,SDS-PAGE電泳及Western Blot分析蛋白表達。超聲破碎菌體,分析蛋白的可溶性并純化收集AIF-1蛋白。結果顯示,pET-28a(+)-hAIF-1質粒經1：mM IPTG誘導4h后,PAGE電泳檢測在約20kDa處有一條明顯條帶,說明重組蛋白主要以可溶性形式存在,鎳柱純化后得到純度較高的AIF-1蛋白。構建穿梭質粒pDC315-EGFP-hAIF-1將穿梭質粒與腺病毒骨架質粒pBHGloxdeltaE13Cre共轉染293細胞包裝腺病毒,獲得表達人AIF-1基因的重組腺病毒,TCID50法測定病毒滴度,用所制備的重組腺病毒感染A549細胞,RT-PCR和Western Blot鑒定A549細胞中AIF-1表達狀態(tài),MTT法檢測細胞增殖,細胞劃痕和Transwell實驗檢測細胞遷移。結果表明,成功構建了表達AIF-1基因的重組腺病毒,所得病毒滴度為2.5×108pfu/ml;用AIF-1重組腺病毒感染人A549細胞,RT-PCR和Western Blot鑒定顯示細胞能夠過表達AIF-1; MTT顯示過表達AIF-1可顯著增強A549細胞增殖能力；細胞劃痕和Tranwell實驗證明過表達AIF-1能夠促進A549細胞遷移。用2%的馬血清培養(yǎng)基誘導C2C12細胞分化,以肌球蛋白重鏈(MHC)的表達作為細胞分化指標,Western Blot和Q-PCR檢測細胞分化過程中AIF-1的表達情況。結果發(fā)現(xiàn),在誘導第3天MHC開始表達,C2C12細胞融合形成肌管,之后肌管不斷增加變粗,MHC表達也逐漸增加,在整個誘導分化過程中,AIF-1的表達在蛋白水平上呈上升趨勢,但在mRNA水平上呈下降趨勢,說明C2C12細胞的分化會影響AIF-1的表達。
【關鍵詞】：AIF-1 原核表達 腺病毒 增殖 遷移 分化
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R54
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 英文縮寫詞表6-9
• 第1章 綜述9-19
• 1.1 同種異體移植物炎癥因子-1(AIF-1)9-13
• 1.1.1 AIF-1的發(fā)現(xiàn)及其類似物9
• 1.1.2 AIF-1基因定位及蛋白特性9-11
• 1.1.3 AIF-1的表達及主要生物學功能11-13
• 1.1.3.1 AIF-1的表達11
• 1.1.3.2 AIF-1與細胞增殖11-12
• 1.1.3.3 AIF-1與細胞遷移12-13
• 1.2 大腸桿菌表達系統(tǒng)13
• 1.3 腺病毒載體13-17
• 1.3.1 腺病毒的一般特性13-14
• 1.3.2 腺病毒載體的研究進展14-17
• 1.4 C2C12細胞的分化17
• 1.5 本實驗研究內容及意義17-19
• 第2章 hAIF-1基因克隆及原核表達19-31
• 2.1 實驗材料19-21
• 2.1.1 菌株及質粒19
• 2.1.2 主要試劑及耗材19
• 2.1.3 主要實驗儀器19-20
• 2.1.4 主要試劑配制20-21
• 2.2 實驗方法21-24
• 2.2.1 hAIF-1基因的克隆(TA克隆)21-22
• 2.2.2 pET-28a(+)-hAIF-1質粒構建22
• 2.2.3 重組質粒的原核表達及鑒定22-23
• 2.2.4 重組蛋白的可溶性分析和蛋白純化23-24
• 2.2.5 數(shù)據(jù)處理24
• 2.3 實驗結果24-29
• 2.3.1 hAIF-1基因的克隆24-26
• 2.3.2 pET-28a(+)-hAIF-1質粒構建26-27
• 2.3.3 重組質粒的原核表達及鑒定27-28
• 2.3.4 重組蛋白的可溶性分析和蛋白純化28-29
• 2.4 討論29-31
• 第3章 hAIF-1基因重組腺病毒的構建及其對A549細胞增殖和遷移的影響31-48
• 3.1 實驗材料31-33
• 3.1.1 菌株、質粒及細胞31
• 3.1.2 主要試劑及耗材31
• 3.1.3 主要實驗儀器31-32
• 3.1.4 主要試劑配制32-33
• 3.2 實驗方法33-39
• 3.2.1 E.coli DH5α感受態(tài)細胞的制備33
• 3.2.2 腺病毒穿梭質粒pDC315-EGFP-hAIF1的構建33-34
• 3.2.3 質粒的大量制備34-35
• 3.2.4 重組腺病毒的包裝35-36
• 3.2.5 PCR鑒定重組病毒36
• 3.2.6 重組腺病毒的擴增36
• 3.2.7 重組腺病毒滴度的測定36-37
• 3.2.8 RT-PCR和Western Blot分析hAIF-1在A549細胞中的表達37-38
• 3.2.9 腺病毒感染A549細胞的增殖實驗38-39
• 3.2.10 腺病毒感染A549細胞的劃痕實驗39
• 3.2.11 腺病毒感染A549細胞的Transwell實驗39
• 3.2.12 實驗數(shù)據(jù)處理39
• 3.3 實驗結果39-45
• 3.3.1 hAIF-1重組腺病毒穿梭質粒的構建39-40
• 3.3.2 hAIF-1重組腺病毒的包裝40-41
• 3.3.3 hAIF-1重組腺病毒鑒定41-42
• 3.3.4 hAIF-1重組腺病毒滴度的測定42
• 3.3.5 RT-PCR和Western Blot分析hAIF-1在A549細胞中的表達42
• 3.3.6 hAIF-1重組腺病毒對A549細胞增殖的影響42-43
• 3.3.7 hAIF-1重組腺病毒感染A549細胞的劃痕實驗43-44
• 3.3.8 hAIF-1重組腺病毒感染A549細胞的Transwell實驗44-45
• 3.4 討論45-48
• 第4章 AIF-1在C2C12細胞分化過程中的表達48-53
• 4.1 實驗材料48
• 4.2 實驗方法48-49
• 4.2.1 小鼠成肌細胞C2C12分化模型的建立48
• 4.2.2 C2C12細胞分化過程中AIF-1表達狀態(tài)分析48-49
• 4.2.3 實驗數(shù)據(jù)處理49
• 4.3 實驗結果49-51
• 4.3.1 小鼠成肌細胞C2C12分化模型的建立49-50
• 4.3.2 C2C12細胞分化過程中AIF-1表達狀態(tài)分析50-51
• 4.4 討論51-53
• 全文總結53-54
• 參考文獻54-59
• 致謝59

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