本文關(guān)鍵詞：JNK通路介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PD-L1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)已經(jīng)成為威脅人類健康的三大殺手之一,也是影響人們生活質(zhì)量的最常見(jiàn)、嚴(yán)重的心血管疾病之一。研究表明,動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病,在動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)有大量的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn),斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)非常明顯；在冠心病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,不論是從脂質(zhì)條紋到粥樣斑塊或纖維斑塊,還是不穩(wěn)定斑塊的生成、破裂、血栓形成,始終都有各種炎癥細(xì)胞的參與。由此可見(jiàn),抑制炎癥細(xì)胞活性,通過(guò)免疫調(diào)節(jié)阻斷炎癥反應(yīng)通路已成為研究及治療冠心病的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。眾所周知,炎癥反應(yīng)的活化與T淋巴細(xì)胞明顯相關(guān),而近年研究表明,負(fù)性刺激信號(hào)(PD-1/PD-L1)對(duì)T淋巴細(xì)胞活化起重要作用。 JNK又稱c-Jun N-末端激酶或者應(yīng)激活化的蛋白激酶(stress activiated protein kinase, SAPK),是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)超家族成員之一,是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶,位于細(xì)胞胞質(zhì)之中,相對(duì)分子量為46×103和54×103,存在特定的功能區(qū)(Thr-Pro-Tyr),其編碼基因?yàn)镴NK1、JNK2和JNK3,其中JNK1和JNK2存在于全身各組織中,而JNK3主要存在于腦、心臟和睪丸等組織。JNK的活化是通過(guò)氨基末端殘基磷酸化實(shí)現(xiàn)的,而JNK的激活可以受多種細(xì)胞外因素的刺激而啟動(dòng),包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-1、TNF-α等)、應(yīng)激刺激(紫外線、細(xì)胞高滲透壓、缺血再灌注損傷)等。一旦JNK激活,JNK將由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中,廣泛參與細(xì)胞凋亡、增殖、代謝及DNA損傷修復(fù)等多種生物學(xué)反應(yīng),而其功能的失調(diào)可造成神經(jīng)退行性病變、缺血再灌注損傷、糖尿病和腫瘤等多種疾病。 程序性死亡因子配體1(programmed cell death ligand1, B7-H1、CD274或PD-L1)是由290個(gè)氨基酸構(gòu)成的Ⅰ型跨膜蛋白。PD-L1是B7家族分子的重要成員,它的受體既不是CTLA-4蛋白(cytotoxic T-lymphocyte Antigen4, CTLA-4),也不是ICOS蛋白(inducible co-stimulator, ICOS)和CD28蛋白,其受體為程序性死亡因子1(programmed cell death1receptor,CD279或PD-1)。在最初的研究中發(fā)現(xiàn),PD-L1在腫瘤細(xì)胞中有高表達(dá),因此,人們推測(cè)PD-L1可能與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)；但近年研究表明,除腫瘤細(xì)胞以外,PD-L1在許多炎癥細(xì)胞上均有表達(dá),如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、星形細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞等等；PD-L1的功能除與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)明顯相關(guān)以外,還與多種疾病發(fā)生有密切的關(guān)系,如移植免疫反應(yīng)、微生物感染(病毒感染)、自身免疫性疾病,近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)與動(dòng)脈粥樣斑塊形成也明顯有關(guān)。Gotsman等用熒光免疫技術(shù)研究冠狀動(dòng)脈時(shí)發(fā)現(xiàn),PD-L1表達(dá)于多處動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)。Lee等研究也發(fā)現(xiàn),冠心病患者較正常人相比,T淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞PD-1/PD-L1表達(dá)均顯著降低,而T淋巴細(xì)胞增殖能力卻增強(qiáng),證實(shí)PD-L1/PD-1與致動(dòng)脈粥樣硬化性T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)有著密切聯(lián)系,能夠負(fù)性信號(hào)調(diào)控冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊形成,在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。雖然現(xiàn)在對(duì)PD-Ll的功能有了一定了解,但對(duì)于PD-1/PD-L1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制目前尚不明了。不同研究對(duì)象及使用不同刺激物所得出結(jié)果不完全相同,總的來(lái)說(shuō),影響PD-L1表達(dá)的細(xì)胞信號(hào)通路可能為PI3K/Akt信號(hào)通路、JAK/STAT信號(hào)通路、NPM/ALK通路、MEK/Erk信號(hào)通路,以及與STAT-3和IRF-1轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。眾所周知,JNK信號(hào)通路是MAPK通路的重要分支,它能通過(guò)細(xì)胞外刺激誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡的發(fā)生。然而關(guān)于PD-L1蛋白表達(dá)與JNK信號(hào)通路的關(guān)系的研究資料甚少。 鑒于以上證據(jù),本課題以體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對(duì)象,利用炎癥因子(LPS)刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模擬病原微生物入侵的模型,觀察臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PD-L1表型的變化；再以JNK蛋白特異性抑制劑SP600125阻斷JNK通路,探討臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1與JNK信號(hào)通路的關(guān)系,闡明LPS誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1蛋白的分子機(jī)制,完善負(fù)性協(xié)同刺激信號(hào)(PD-1、PD-L)調(diào)控T淋巴細(xì)胞活性的機(jī)理,有望為動(dòng)脈粥樣硬化的免疫治療的提供新的思路及理論基礎(chǔ)。 目的 1.LPS能否誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1。 2.以JNK蛋白特異性抑制劑SP600125阻斷JNK信號(hào)通路后,觀察樹突狀細(xì)胞受炎癥因子刺激后PD-L1表型變化,探討樹突狀細(xì)胞表達(dá)PD-L1與JNK信號(hào)通路的關(guān)系。 對(duì)象和方法 1、對(duì)象 體外培人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。 2、方法 2、1臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離、鑒定及傳代培養(yǎng) 無(wú)菌條件下,取健康產(chǎn)婦剖腹產(chǎn)后新鮮的胎兒臍帶,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液清洗,用I型膠原酶消化、離心,加入含20%胎牛血清的M199培養(yǎng)液,放入5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)中37℃培養(yǎng)。24h后換液,待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)鋪滿瓶底80%-90%,以0.125%胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng),并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài),選擇生長(zhǎng)良好的第4～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。采用形態(tài)學(xué)和內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ相關(guān)抗原進(jìn)行鑒定。 原代的細(xì)胞一般培養(yǎng)4-5天后細(xì)胞可長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底95%以上,顯微鏡下觀察細(xì)胞融合成單層呈鋪路石狀,此時(shí)可傳代。棄去培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)液,用PBS(37℃預(yù)熱20分鐘)洗滌2-3次,加入1ml0.125%的胰蛋白酶(37℃預(yù)熱20分鐘)室溫消化細(xì)胞20s,顯微鏡下觀察細(xì)胞皺縮變圓、彼此分離即可將胰蛋白酶吸出,然后加入M199完全培養(yǎng)液終止消化,吸管輕柔吹打至均勻細(xì)胞懸液,按1：2傳代培養(yǎng)。 2.2程序降溫法凍存內(nèi)皮細(xì)胞,快速融化法復(fù)蘇細(xì)胞 2.2.1內(nèi)皮細(xì)胞的凍存 用一次性吸管吸去培養(yǎng)瓶中廢棄的培養(yǎng)液,再用PBS洗滌細(xì)胞2次。以0.125%胰酶消化20秒,顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓、皺縮。用一次性吸管吸出胰酶,凍存液加入培養(yǎng)瓶中終止消化。彎頭吸管吹打瓶中細(xì)胞數(shù)分鐘,顯微鏡下觀察細(xì)胞全部脫落。再將細(xì)胞懸液加入凍存管中,標(biāo)記日期、細(xì)胞種類,封口膠封口。 細(xì)胞程序降溫：4℃冰箱20分鐘→-20℃冰箱1小時(shí)→-70℃冰箱過(guò)夜→次晨投入液氮罐。 2.2.2內(nèi)皮細(xì)胞的復(fù)蘇 用鑷子從液氮罐中取出標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞的凍存管,將其迅速放入37℃水浴箱中充分搖晃至凍存管中細(xì)胞完全解凍(大約1分鐘)。用酒精擦拭凍存管后入超凈工作臺(tái)。在15m1離心管中預(yù)先加入3倍凍存細(xì)胞體積的M199完全培養(yǎng)基,用一次性吸管將細(xì)胞液吸出加入離心管中混勻。低速離心：300rpm離心5分鐘或500rpm離心3分鐘。去上清,加培養(yǎng)液培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶置入孵箱中培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)滿后進(jìn)行傳代。 2.3實(shí)驗(yàn)分組(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次) 收獲第五代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/ml,接種于6孔培養(yǎng)板中。根據(jù)是否使用LPS和JNK蛋白特異性抑制劑SP600125將實(shí)驗(yàn)分成三組：陰性對(duì)照組、LPS組和SP600125+LPS組(LPS及SB203580均用二甲基亞砜(DMSO)溶解) 第一組為陰性對(duì)照組(NORMAL):將未加入任何藥物的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)作為陰性對(duì)照。 第二組為L(zhǎng)PS刺激組(LPS)：首先在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中加入DMSO (0.1%V/V)作用1小時(shí),再加入LPS (1.0μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)(LPS每12h半量換液)； 第三組為SP600125+LPS共刺激組：首先在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中加入SP600125(20μmol/L)作用1h后再用LPS刺激24h(LPS每12h半量換液)。 2.4Western blot檢測(cè)PD-L1蛋白 自6孔培養(yǎng)板中提取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,用RIPA細(xì)胞裂解液抽提全細(xì)胞蛋白樣品,并經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%的脫脂奶粉封閉2h,加入抗PD-L1多克隆抗體,4℃孵育過(guò)夜,PBS洗膜后加入二抗,37℃孵育2h后ECL發(fā)光,暗室中曝光、顯影、定影。Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的光密度值。 2.5Western blot檢測(cè)P-JNK、JNK蛋白 自6孔培養(yǎng)板中提取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,用RIPA細(xì)胞裂解液抽提全細(xì)胞蛋白樣品,并經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%的脫脂奶粉封閉2h,加入抗p-JNK多克隆抗體和抗JNK多克隆抗體,4℃孵育過(guò)夜,PBS洗膜后加入.抗,37℃孵育2h后ECL發(fā)光,暗室中曝光、顯影、定影。Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的光密度值,以p-JNK/JNK蛋白光密度的比值代表p-JNK的光密度值,分別算出陰性對(duì)照組、LPS組、SP600125+LPS組光密度的比值。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),多重比較采用SNK-q檢驗(yàn),P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.結(jié)果 4.1MTT檢測(cè)HUVECs增殖 各組臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞OD值測(cè)定。陰性對(duì)照組OD值為0.32±0.003,LPS組0D值為0.34±0.033,SP600125+LPS組OD值為0.31±0.018,各組OD值比較P0.05,各組細(xì)胞增殖無(wú)顯著差異。 4.2Western blot檢測(cè)PD-L1蛋白 Western blot曝光灰度掃描結(jié)果(Z值)顯示,LPS組為1.12±0.72,SP600125+LPS組為0.66±0.36,對(duì)照組為0.59±0.30。SP600125+LPS組與對(duì)照組Z值均小于LPS組(P0.05或P0.05),SP600125+LPS組Z值與陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異(P0.05)。 4.3Western blot檢測(cè)JNK、P-JNK蛋白 Western blot曝光灰度掃描結(jié)果(Z值)顯示,LPS組為1.26±0.09,SP600125+LPS組為0.49±0.18,對(duì)照組為0.95±0.21。SP600125+LPS組Z值均小于其它2組(P0.05或P0.05),LPS組Z值顯著大于對(duì)照組(P0.05)。 5結(jié)論 1、LPS可以誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PD-L1表達(dá)增高； 2、JNK信號(hào)通路可能參與調(diào)控臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PD-L1。
【關(guān)鍵詞】：程序性死亡因子配體1 JNK信號(hào)通路 SP600125 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R541.4
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-20
• 第一章 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定20-30
• 1 材料和方法20-25
• 2 結(jié)果25-26
• 3 討論26-29
• 4 結(jié)論29-30
• 第二章 JNK通路介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PD-L1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究30-48
• 1 材料和方法30-34
• 2 實(shí)驗(yàn)方法34-41
• 3 結(jié)果41-43
• 4 討論43-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 中英文縮略詞對(duì)照表54-55
• 綜述55-64
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 攻讀學(xué)位期間成果64-65
• 致謝65-67

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9 南方周末記者 黃永明　南方周末實(shí)習(xí)生 王寅;讓免疫學(xué)進(jìn)入細(xì)胞和分子層面[N];南方周末;2011年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 趙延濤;LPS致流產(chǎn)作用及保胎中藥的調(diào)控效應(yīng)研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

2 鄧小鹿;p115RhoGEF/RhoA信號(hào)通路參與調(diào)控LPS及TNF-α致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高的機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2012年

3 張樂(lè)蒙;IRF-1對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2012年

4 王彪;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠DIC模型的器官保護(hù)作用[D];山東大學(xué);2013年

5 秦文星;AOG抑制LPS誘導(dǎo)的TLR-4/MD-2/NF-κB信號(hào)通路活化的機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

6 許敏;HIF-1α在丹參酮ⅡA減輕內(nèi)毒素性急性肺損傷中的作用及其機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

7 劉耀;鱟抗內(nèi)毒素因子模擬肽CLP-19抑制LPS的免疫應(yīng)答作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

8 曲忠花;HBV對(duì)補(bǔ)體殺傷作用的影響及LPS對(duì)胞內(nèi)DNA免疫的作用研究[D];山東大學(xué);2010年

9 曲玲;LRP16基因調(diào)控LPS/TLR4信號(hào)通路的作用與機(jī)制研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2012年

10 朱濤;穿心蓮內(nèi)酯通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI/ARDS的保護(hù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 楊倩;槲皮素抗LPS致小鼠胚泡著床障礙作用的研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

2 刁歡;多不飽和脂肪酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷的作用及機(jī)理研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

3 刁歡;多不飽和脂肪酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷的作用及機(jī)理研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

4 徐棟花;乳酸桿菌對(duì)LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎癥性細(xì)胞因子釋放的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制[D];南京醫(yī)科大學(xué);2011年

5 錢鳳英;MEKK3在LPS刺激后惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生IL-6作用中的初步研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

6 鄧華明;蛇床子素對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響[D];暨南大學(xué);2011年

7 李楊;LPS對(duì)羧酸酯酶1和2（CES1、CES2）表達(dá)的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

8 董莎莎;云芝糖肽（PSP）對(duì)LPS刺激的小鼠巨噬細(xì)胞ROS及MAPK信號(hào)通路的研究[D];上海師范大學(xué);2011年

9 劉靜;乳酸抑制LPS激活大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB通路的研究[D];北京農(nóng)學(xué)院;2011年

10 馮琳琳;LPS、TGF-β1對(duì)小鼠BMDC的影響及TGF-βRⅠ在哮喘遺傳背景不同小鼠BMDC中的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：JNK通路介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PD-L1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：405788